工程菌的高效表达和.pptVIP

2.接种量的影响 接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。接 种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利 于外源基因表达；接种量大，可缩短生长延迟 期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适 于表达外源基因；接种量过高，使菌体生长过 快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的 生长。 * 3.温度的影响 温度对发酵过程的影响是多方面的。它影响各 种酶的反应速度，改变菌体代谢产物的反应方 向，影响代谢调控机制。适宜的发酵温度是既 适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度 。高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的 形成并导致减产。温度还影响蛋白质的活性和 包含体的形成。 * 4.溶解氧的影响 对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。好氧微生物利用溶解 于培养液中的氧气进行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率 ，则能提高发酵产率。发酵时，随溶解氧浓度的下降，细胞生 长减慢，发酵后期下降幅度更大。外源基因的高效表达需要大 量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。维持较高 的溶解氧值，才能提高工程菌的生长，利于外源蛋白产物的形 成。采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供给，提 高活菌产量。 * 5. pH的影响 根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当 的调节。如采取两段培养工艺，培养前期重点 是优化工程菌的生长条件，培养后期重点是优 化外源蛋白的表达条件。 * 6.诱导时机的影响 一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表 达。在对数生长期，细胞快速繁殖，这时菌体 数目倍增，对营养和氧需求量急增，营养和氧 成了菌群旺盛代谢的限制因素。 7.诱导表达程序的影响 热诱导的程序提高外源蛋白表达量。 * 基因工程菌的不稳定性 基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。 质粒不稳定可分为： 　　 分裂不稳定 　　 结构不稳定 * 分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。 结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变 * 导致质粒不稳定的常见的三个因素： 1.含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； 2.这两种菌比数率差异的大小; 3.插入的外源基因影响了质粒稳定区的结构 。 * 对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数： 低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性； 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。 * 质粒稳定性的分析方法 样品 不含抗性标记抗生素 平 板 培 养基 10-12h 100个菌落 含抗性标记抗生素 平 板 培 养 基 10-12h 统计生长菌落数 重复三次,计算比值 (稳定性stability) * 提高质粒稳定性的方法 1.选择合适宿主菌 宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特性、染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列等都会影响质粒的稳定性。 * 2.选择合适的载体 改造、构建能稳定表达的质粒载体是构建工程菌的重要一环。针对不同的载体及不同的目的采取不同的策略。 3.选择压力 从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。 * 4.分段控制培养 提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定。 可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达。 * 5.控制培养条件 对于一个已经组建完成的工程菌来说，选择最适的培养条件是进行工业化生产的关键 步骤。 环境因素对质粒稳定性的影响机制错综复杂，许多尚属未知。 在众多的环境因素中，培养基的组成、培养温度、菌体的比生长速率3个方面尤其重要。 * 1）培养基的组成 培养基对克隆菌稳定性的影响 培养基 克隆菌 F20-25 不稳定型 PBB W3110trpAE1trpR tnaA 7% 结构性 MM (RSF 2124-trp) 99% 结构性 PBB W3110 trpAE1 trpRam27 12% 分配性 MM (pSC101