3 第二章 胞分离与胞内产物的溶解 (3h).pptVIP

* 包涵体获得几种常见的工艺路线（三） 化学破碎 （加变性剂） 离心除细胞碎片 除变性剂复性 * 用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。 缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。 路线三： * 1）包涵体的洗涤 细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。 洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。 洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。 洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。 * 2）目标蛋白的变性溶解 包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。 常用变性剂： ▲ 5-8 mol/L盐酸胍和6-8 mol/L尿素, 作用：破坏离子间相互作用； ▲ 表面活性剂如1-2％ SDS， 作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。 ▲ PH9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。 影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和浓度。 * 原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。 复性方法： 稀释法除变性剂 － 加入大量水或缓冲液。 膜分离法除变性剂 － 透析、超滤、电渗析。 层析法：凝胶层析，高效疏水层析 3） 目标蛋白的复性 * 蛋白质复性影响因素： 变性剂浓度 目标蛋白浓度； pH和离子强度； 氧化还原条件。 还原剂： 二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、还原型谷胱甘肽； 氧化剂： 氧化型谷胱甘肽; 碱性下通空气。 复性区 多聚物生成区 絮凝沉淀区 盐酸胍浓度mol/L 红血球碳酐酶复性操作中变性剂 与蛋白质浓度对复性的影响 蛋白质浓度 mol/L * 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在E.coli中的高密度发酵过程中以两种形式表达： ◆ 细胞内有活性的可溶性蛋白形式（约占目标蛋白的30%） ◆ 无活性的包涵体形式（约占目标蛋白的70%）。 悬浮破壁 PBS 洗涤 离心 硫铵沉淀 亲和层析 阳离子交换层析 溶解 复性 亲和层析 湿菌体 发酵液 干净菌体 上清液 包涵体 纯品 活性检测 破壁液 离心 离心液 洗涤 举例:(1)TRAIL的分离纯化 * 包涵体的洗涤 ① 粗制包涵体用 50mM磷酸盐缓冲液，含150mM NaCl pH=7.4 (1:3 w/v) 洗涤2-3次； ② 用含有1M NaCl的磷酸缓冲液洗涤1次 (1:3 w/v)，将粘附其表面的大部 分蛋白及水溶性杂质除去； ③ 用6M尿素及0.5%TritonX-100 联合洗涤1次 (1:3 w/v)，去除另一些 杂蛋白，这时得较纯包涵体（纯度达80%左右）； ④ 用SDS电泳检测纯度。 包涵体的变性溶解 ① 洗涤后包涵体用含有30mM DTT及5mol/l盐酸胍的Tris 缓冲液 pH =8.0 (1:5 w/v)变性溶解 → 室温搅拌2h，95%以上的包涵体可被溶解； ② 离心，13000rpm，20min → 弃沉淀得到溶解液。 * 包涵体复性（间歇式流加稀释复性法） 以含DTT和ZnSO4的Tris-HCl为复性缓冲液，再添加0.4M L-Arg，0.5M尿素，0.5M NaCl作为蛋白聚集抑制剂， 变性溶解液可多次流加，每次流加的时间是以上一次流加蛋白已达到部分复性为准。本实验中，流加间隔时间确定为90min，每次流加浓度为150mg/L，变性液流加次数可高达6次，最终浓度可达到1mg/ml，4℃缓慢搅拌一段时间， 对50mM Tris-HCl，300mM NaCl，0.1M尿素及0.2mM ZnSO4 混合液透析过夜，透析后离心除去复性过程中聚集的蛋白， 超滤浓缩（也可用硫酸铵沉淀进行浓缩）得复性蛋白液。 * 复性后纯化 复性浓缩后蛋白 金属亲和层析 吸附 洗涤： 40m