小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型.pdf

小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型 缺血再灌注损伤，即缺血器官、组织重新获得血液供应，不仅不能使组织、 器官功能恢复，反而加重了功能代谢障碍及结构破坏。对麻醉动物的肝中叶和肝 左叶的门静脉和肝动脉进行阻断和再通，由于肝脏中叶和左叶血流的阻断和再 通，引起肝脏中叶和左叶明显的再灌注损伤。肝脏缺血过程中由于肝细胞内ATP 迅速耗尽，导致乳酸酮体等的堆积，及线粒体氧化磷酸化功能低下，引发代谢性 酸中毒，缺血过程中细胞缺氧使ATP 含量下降，导致肝细胞内外Ca2 +重新分布， 即Ca2 + 内流，引起线粒体的损伤。再灌注过程中由于氧自由基的爆发性增多， 中性粒细胞的聚集，kupffer 细胞的激活，细胞凋亡及其他多种细胞因子的作用， 使得肝细胞膜损伤，内皮细胞损伤及肝脏微循环障碍等导致肝脏功能代谢障碍及 结构破坏。 1.实验动物 SPF 级Balb/C 小鼠，雄性，周龄为4w~6w ，体重为20g~22g 。 2.实验分组： 实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组 15 只动物。 3.实验周期 0h、3h、6h、12h、24h 、72h 4.建模方法 1 小鼠术前12 h 禁食，自由饮水。 2 3%戊巴比妥钠80mg/kg 腹腔注射麻醉，麻醉成功后将小鼠平躺在手术台上胶 带固定四肢，将小鼠腹部术去毛，用碘酒和75 ％乙醇术区消毒。 3 取腹正中切口1cm，打开腹腔，小心分离出肝脏左、中叶之肝蒂（左、中叶肝 脏供血的门静脉和肝动脉）。 4 用无创血管夹夹闭中叶和左叶的门静脉和肝动脉，使约70%的肝脏缺血，以防 止发生严重肠系膜静脉淤血。0.5min 后，与非阻断的右叶相比，肉眼可见阻断叶 明显变白，说明阻断成功，用止血钳夹闭皮肤切口临时关闭腹腔，同时将小鼠放 在37℃恒温加热垫上保温。 5 完成持续缺血60min 后，重新打开腹腔，迅速取出血管夹，恢复缺血肝血流， 0.5min 左右可见缺血区肝脏由白色逐渐恢复为鲜红色表明再灌注成功，逐层缝合 腹腔肌肉和皮肤关闭腹腔，完成手术。待小鼠清醒后放回饲养室饲养，密切关注 小鼠的状态及生存状况并做好记录。 6 术后分别于再灌注0h、3h、6h、12h、24h 及72h 麻醉小鼠，摘眼球取血，室 温静置2h 后于4℃3000r 离心10 分钟提取血清，放入-80 冰箱冻存。采用全自动 生化分析仪检测血清中ALT （谷丙转氨酶）、AST （天门冬氨酸氨基转移酶）的 水平。同时统一取肝左叶组织1．5cm × 1cm× 0．2cm 留作病理标本或分生标本。 5.模型评价 1 分别检测术后0h、3h、6h、12h、24h 及72h 小鼠血清中ALT （谷丙转氨酶）、 AST （天门冬氨酸氨基转移酶）的水平。 2 统一取肝左叶组织1．5cm × 1cm× 0．2cm 于4%多聚甲醛溶液中固定24h 后脱 水，包埋，进行石蜡切片后行HE 染色，tunel 染色。作坏死评分。肝小叶结构严 重破坏，网状纤维支架塌陷，肝细胞坏死，空泡变样，肝细胞索、肝窦充血肿胀， 边界不清，周围有炎性细胞浸润。 肝脏缺血损伤评分： 0 分：无肝细胞损伤 1 分：轻度损伤，特点为细胞质空泡化，病灶核固缩 2 分：中度损伤，血窦膨胀，细胞溶质空泡化，细胞边界模糊 3 分：中度到重度损伤，凝固性坏死，大量血窦膨胀，红细胞渗出到肝锁，嗜伊 红细胞增多，中性白细胞着边（附着于血管壁） 4 分：严重坏死，失去肝脏结构，肝索崩解，出血，嗜中性粒细胞渗入 3 细胞因子的检测 肝脏损伤后，血清中TNF α、IFN γ、IL-2 、IL-6、ICAM1 等细胞因子的表达显 著升高，可以用ELISA 法检测。 6 注意事项 6.1 分离肝门时用棉签分离，可避免对肝脏的损伤 6.2 术前禁食有利于手术进行 6.3 阻断血流要一次成功，否则会造成缺血预处理，减轻损伤程度 6.4 取材时镊子不要损伤肝脏 Control Model 图1 对照组小鼠肝细胞以中央静脉为中心呈放射性排列；肝脏缺血再灌注损伤 小鼠自中央静脉周围开始坏死，肝细胞空泡样变性，炎症细胞浸润，少数肝细胞