植物器官的组织培养.docx

成绩： 日期：2015年12月18日南京林业大学实验报告专业 学号姓名实验三植物器官的组织培养一．实验目的：1．掌握无菌操作的植物组织培养方法；2．通过配置MS培养基母液，掌握母液的配置和保存方法；3．了解植物细胞通过分裂、增殖、分化、发育, 最终长成完整再生植株的过程, 加深对植物细胞的全能性的理解。二、实验原理（一）植物组织培养植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化作用”。（二）植物细胞的全能性植物细胞的全能性即是每个植物的本细胞或性细胞都具有该植物的全套遗传基因，在一定培养条件下每个细胞都可发育成一个与母体一样的植株。（三）组织的分化与器官建成外植体诱导出愈伤组织后，经过继代培养，可以在愈伤组织内部形成一类分生组织即具有分生能力的小细胞团，然后，再分化成不同的器官原基。有些情况下，外植体不经愈伤组织而直接诱导出芽、根。（四）培养基的组成培养基中各成分的比例及浓度与细胞或组织的生长或分化所需要的最佳条件相近，似成功地使用该培养基进行组织培养的主要条件。营养培养基一般由无机营养、碳源和能源、维生素、植物激素（生长调节剂）和包括有机氮、酸和复杂物质的添加剂组成。三、材料与仪器1、试剂：MS1:25ml、MS2:2.5ml、MS3:2.5ml、MS4:2.5ml、NAA0.1:0.25ml、BA0.5:1.25ml、蔗糖：15g、琼脂：2.75g2、其它：高压灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养室镊子、记号笔、橡皮筋、玻璃器皿、三角烧瓶、烧杯、量筒、剪刀、棉塞、绳子、牛皮纸、酒精灯、喷雾器等。 3、材料：银杏种子4、药品：70% 酒精、MS培养基、蒸馏水、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、蔗糖、琼脂等。四、实验步骤1）培养基的配制（一）称量根据用量按比例依次称取成分，将上述量取的溶液混合于1L大烧杯中。（二）定容加蒸馏水至500ml，搅拌均匀。（三）调PH 用1mol/L NaOH或1mol/L HCl把PH调至5.8 ，调pH不要过头。PH6.5培养基会变硬，PH5.0培养基不易凝固。（四）加热溶解置于电磁炉加热至沸腾（五）分装将500ml的溶液分别装进30个试管中，一般来说，分装到培养容器中的培养基应占该容器的1/3-1/4为宜，太多造成浪费，太少不易接种和影响生长。（六）封口培养基分装后，应该立刻用封口膜将容器口部封严。2）培养基的消毒将分装好的培养基放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右，灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。3）银杏种子的接种1、准备打开超净工作台，将镊子酒精灯放如超净工作台中，用紫外灯照 20min后关闭紫外灯，同时将银杏种子用自来水冲20min关闭紫外灯后在台上点燃 2 个酒精灯，用棉球将镊子烧4次，超净作台少2次。将灭菌溶液，无菌水，豌豆，大烧杯等放入超净工作台。2、灭菌在超净工作台上取经浸泡处理的银杏，先用酒精倒入种子瓶中约2／3 消毒一次（1-2s）接着用无菌水冲洗一次。再用84 消毒液摇晃清洗清洗 3 次，每次 5 分钟，清洗完后用无菌水冲洗一次。而后用 0.5%HgCl 泡8min，处理 2 次，每次 5 分钟。后用无菌水摇晃清洗 4-5次。3、接种将所要用的三角瓶用75％的酒精喷湿，接着把手喷湿并把三角瓶带入超净工作台。接着将灭菌处理好的银杏种子在超净工作台上用镊子靠近酒精灯的外焰放入向下倾斜的锥形瓶杯中，接种过程中锥形瓶应一直保持向下倾斜，直到接种完毕盖上棉塞，贴上标签，放入培养室中。4、标记接种完毕后，用棉线绑好用铅笔在牛皮纸标上制作人和日期，放入有光的培养架上。5、定期观察种子的萌发情况和外植体的分化情况。五、结果六、注意事项1、在使用提前配置好的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物感染，应立即淘汰这中母液，重新进行配制。2、用量筒或移液管取培养基母液之前，必须用所取的母液讲量筒或移液管润洗两次。3、量取的顺序写在纸上，量取一种，划掉一种，以免出错。4.在灭菌之前一定要检查锅中的水位，严禁干烧，以免造成事故。5.灭菌前还需检查排气阀是否关上。6.只有当锅中压力为零时才能打开锅盖否则会有危险。7.锅内应留有空隙，不能太满。8.灭菌时间不宜过长，也不可以超过灭菌锅规定的压力范围。9.严格按照规范进行操作。七、思考与反思这次实验有成功也有失败，成功的是因为在接种时保证了培养基没有被污染，使