姜黄素诱导人结肠癌细胞株SW480凋亡及其bcl2表达相关性研究.docVIP

　　姜黄素诱导人结肠癌细胞株SW480凋亡及其bcl2表达相关性研究 【摘要】 探讨姜黄素对人结肠癌细胞株STT法检测细胞的生长活性，流式细胞仪检测细胞周期，TUNEL法检测细胞凋亡，免疫组化法检测细胞内bcl2蛋白表达水平。结果 MTT显示姜黄素对S结果显示细胞周期中G0/G1期细胞比例增加，S期、G2/M期比例下降。TUNEL法显示凋亡细胞数增加，免疫组化结果显示bcl2基因表达明显减弱。结论 姜黄素能抑制结肠癌STT(噻唑蓝)为美国Sigma公司产品。小牛血清、RPMI1640为美国GIBCO公司产品。细胞凋亡原位检测试剂盒为德国BoehringerMannhEim公司产品。bcl2免疫组化试剂盒为武汉博士德公司产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 SI1640培养基，37℃、5%CO2培养箱中常规传代培养。设对照组和实验组,并根据实验要求加入不同浓度的试剂。 　　1.2.2 噻唑蓝还原法(MTT法)检测细胞生长抑制率 取对数生长期细胞5×104个/ml，每孔0.2ml，接种于96孔组织培养板中，设PBS对照组和不同浓度(5～50μmol/L)的实验组，各设3个复孔。置37℃、5%CO2培养箱中培养， 分别作用6h、12h、24h、48h，实验终止前4h每孔加MTT(5mg/ml)工作液20μl，上机前除去培养液，每孔加200μl二甲基亚砜，在酶标仪(570nm波长)上测量各孔吸光度值(OD值)，按下列公式 计算 细胞生长抑制率。 　　抑制率(%)=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100% 　　1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期 消化收集各实验组及对照组分别培养24h的细胞，调整细胞悬液浓度为1×106/ml，上流式细胞仪 分析 。用multicycle DNA分析软件进行细胞周期的测定。 　　1.2.4 TUNEL法检测细胞凋亡 操作步骤按试剂盒说明进行。结果判定：细胞核染为棕黄色的细胞被判定为凋亡细胞。随机选取5个高倍视野（400倍），分别计数凋亡细胞数和细胞总数，计算凋亡指数(apoptosis index，AI)。 　　AI=(凋亡细胞数/细胞总数)×100% 　　1.2.5 免疫组化法检测bcl2的表达 按照SABC试剂盒使用说明书操作。显色后用图像分析仪进行图像分析。随机测定100个细胞，测出阳性反应细胞的总面积(Area)和积分光密度(IOD)，然后求出平均光密度(Dλ)值。 　　1.2.6 统计学分析 实验数据以±s表示，进行方差分析。 　　2 结果 　　2.1 姜黄素对S期最少。对照组DNA组方图为典型肿瘤细胞的G0/G1、S、G2/M峰型。从表2可以看出，细胞周期发生明显变化。G0/G1期比例降低，S期、G2/M期比例均增高，呈剂量依赖关系。提示姜黄素可阻断癌细胞从G0/G1期到S期的 发展 。 　　2.3 TUNEL法检测细胞凋亡 结果显示，光镜下阳性细胞及凋亡细胞核染成棕黄色，细胞由梭形变成圆形，细胞皱缩，细胞核固缩，核碎裂等。由表3可以看出，姜黄素可诱导癌细胞凋亡，且呈剂量依赖关系，且各浓度组间差异具有显著性(Plt;0.05)，见图1。 　　表2 姜黄素对STT法发现姜黄素对S期细胞比例明显减少，说明细胞生长被阻滞于S期和 G2/M期，并且此作用同样具有浓度依赖性。Ｍehta等[5]报道，以姜黄素处理的数株人乳腺癌细胞均可发生G2/M期停滞，但未观察到细胞周期蛋白(cyclin)Ｂ的明显变化。经姜黄素处理的人结肠癌细胞HT29和HCT15也同样发生G2/M期停滞[6]。而许建华等[7]的研究表明姜黄素处理的人肝癌细胞BEL7402则发生S期停滞。这些结果表明，对于不同组织类型的癌细胞来说，姜黄素对细胞周期的调控可能存在不同的机制。本实验结果表明，姜黄素具有直接杀伤肿瘤细胞的作用，其干扰细胞周期使阻断于S期和 G2/M期可能是姜黄素抗癌作用的重要机制。 　　肿瘤的发生与细胞凋亡的异常有密切关系，肿瘤细胞凋亡是一个多基因参与调控的复杂过程，凋亡可使肿瘤细胞主动性自杀性死亡。其中bcl2家族是其中最重要的基因之一，其编码的蛋白能抑制细胞凋亡。bcl2通过许多刺激因素如神经营养和增长因子的缺乏、Ca++渗透、热休克、辐射和某些病毒等而阻止细胞死亡，可导致DNA受损的细胞持续生存、突变产物聚集，从而促进肿瘤的发生 发展 。它调节细胞凋亡的作用点可能是影响线粒体释放细胞色素C[8]。姜黄素能显著诱导Hras转化的人乳腺上皮细胞MCF10A细胞凋亡，并在mRNA和蛋白水平下调bcl2基因的表达[9]。Miyashita发现bcl2蛋白能抑制抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡[10]。实验结果表明，姜黄素能诱导SM，et al.Curcumin prevents