富组蛋白5表达质粒构建及抗菌功能研究.docVIP

　　富组蛋白5表达质粒构建及抗菌功能研究 作者：李岩，李明　陈伟强，邝枣园，黄宁 【摘要】 目的 构建富组蛋白5(histidinerich protEin5,HRP5)重组表达载体，表达并纯化HRP5蛋白，观察其抗菌作用。方法 用基因克隆的方法构建pET32aHRP5重组表达质粒，经IPTG诱导表达后，用亲和层析的方法纯化HRP5融合蛋白，TricineSDSPAGE电泳鉴定其分子量，琼脂糖弥散法检测其抗菌功能。结果 成功构建了pET32aHRP5表达质粒并表达、纯化出HRP5融合蛋白，融合蛋白对致病性大肠杆菌54299和绿脓杆菌PAO1有抗菌活性。结论 HRP5是一种抗菌分子，参与了机体的天然免疫防御功能。 【关键词】 富组蛋白5;蛋白表达; 亲合层析;抗菌活性 Abstract:Objective To express and purify rebinant HRP5 protEIn and investigate its antimicrobial activity.Methods The rebinant prokaryotic expressing plasmid pET32aHRP5 icrobial activity of HRP5 atography and shoonas aeruginosa PAO1.Conclusion HRP5 protein is a potent antimicrobial molecule and it is involved in the defense of the innate immunity in vivo. 　　Key atography; antimicrobial activity 　　 富组蛋白(histidinerich proteins,HRPs)为一组分子量为3～5 kD、分子中富含组氨酸的阳离子多肽，主要由灵长类动物腮腺和颌下腺分泌。1984年研究者首次报道了HRPs对变形链球菌、白色念珠菌有抑制生长和杀菌作用[1,2]，随后的研究显示HRPs作为一组内源性抗菌肽，参与宿主非特异性免疫防御系统，与多种口腔感染性疾病密切相关。在至少由12种蛋白组成的HRPs家族中，HRP1、3、5作为主要富组蛋白，其蛋白质之和占HRPs总含量的85%以上。HRP5是HRP3的蛋白裂解产物，由HRP3 N末端的24个氨基酸残基组成，是HRPs家族中抗菌效果最强的蛋白[3，4]。本实验利用基因克隆的方法构建了pET32aHRP5重组表达质粒，经IPTG诱导后，用亲和层析的方法获得纯化的HRP5融合蛋白，并用琼脂糖弥散法抗菌实验证实重组蛋白的抗菌功能。 　 　1 材 料 　　1.1 主要试剂 　　琼脂糖、溶菌酶、胰蛋白胨、酵母提取物、大豆培养基、过硫酸铵、Tris、Tricine (Sigma公司);丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、蛋白质Marker (Merck公司);考马斯亮蓝R250 (上海试剂厂进口分装产品);连接试剂盒、限制性内切酶、Taq酶(Fermentas公司);质粒提取试剂盒、PCR纯化试剂盒(Omega 公司);IPTG(华美公司);引物、Trizol试剂、DEPC及两步法RTPCR试剂盒(Takara公司);HisTrap Kit (Amersham公司);致病性大肠杆菌54299、绿脓杆菌PAO1、宿主菌DE3及原核表达质粒pET32a均为本室保存。 　　1.2 主要仪器 　　纯水仪(Millipore公司);超净工作台(苏净集团);PCR 仪(Biometra公司);凝胶成相仪(Amersham公司);低压色谱仪(Amersham公司)。 　2 方 法 　　2.1 HRP5分子片段的制备 　　腮腺组织来源于人因腮腺纤维瘤切除腮腺的正常腮腺组织部分，按说明书用Trizol法提取总RNA为模板，以Oligod(T)18为引物逆转录合成第一链cDNA。根据Gene Bank(登陆号：BC009791，HRP3)设计特异性引物，上游引物P1：5’CCG GGA TCC GAT TCA CAT GCA AAG AGA CA3’,含Bam HⅠ酶切位点，下游引物P2：5’CTG GAG CTC ATC GCC TCG ATG TGA ATG3’。含Sal Ⅰ酶切位点，扩增HRP3 N末端的24个氨基酸编码序列。PCR反应条件为：95 ℃预变性2 min，94 ℃ 变性30 s，53 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸45 s，进行30个循环，最后在72 ℃ 延伸10 min。PCR反应结束后，取5 μL琼脂糖凝胶电泳鉴定，并进行纯化。 　　2.2 HRP