层析方法三维-扫描.doc

层析方法“三维”扫描 层析法又称色层分析法或色谱法，它是在1903-1906年由俄国植物学家茨维特首先系统提出来的。他将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱，并继续以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图。而如今的色层分析法经常用于分离无色的物质，已没有颜色这个特殊的含义，但色谱法或色层分析法这个名字仍保留沿用至今。 层析法实质上是一种物理化学分离分析方法，它是利用混合物中各组分物理或化学性质的差异（如吸附力、溶解度、分子形状、分子大小以及极性分子所带电荷的性质和数量、分子表面的特殊基团等），由一种流动相带着试样经过固定相，物质在两相之间进行反复的分配，由于各组分在两相之间的分配系数不同，移动速度也不一样，最后使各组分得以彼此分离开来。 根据层析法中两相的性质和操作方法不同，层析法有许多类型，在此仅就几种常用的方法进行介绍，以飨读者。 一．吸附层析 吸附层析是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析方法。吸附层析是把吸附剂装入玻璃柱内（吸附柱层析法）或铺在玻璃板上（薄层层析法），由于吸附剂的吸附能力可受溶剂影响而发生改变，样品中的物质被吸附剂吸附后，用适当的洗脱液冲洗，改变吸附剂的吸附能力，使之解吸，随洗脱液向前移动。当解吸下来的物质向前移动时，遇到前面新的吸附剂又重新被吸附，此被吸附的物质再被后来的洗脱液解脱下来，经如此反复的吸附-解吸-再吸附-再解吸的过程，物质即可沿着洗脱液的前进方向移动，其移动速度取决于吸附剂对该物质的吸附能力。由于同一吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同，所以在洗脱过程中各组分便会由于移动速度不同而逐渐分离出来，这就是吸附层析的基本过程。 对吸附剂的基本要求是：1.具有较大的吸附表面和一定的吸附能力；2.与洗脱液及样品中各组分不起化学反应，在洗脱液中不溶解；3.吸附剂的颗粒要有一定的细度，并且粒度要均匀。实验中常用的固体吸附剂有碳酸钙、氧化铝、硅胶、活性炭、纤维素等。常用的洗脱液有乙烷、苯乙醚、氯仿，以及乙醇、丙酮或水与有机溶剂形成的各种混合物。吸附层析通常用于分离脂类、类固醇类、类胡罗卜素、叶绿素以及它们的前体等非极性和极性不强的有机物。 二．凝胶过滤层析 凝胶过滤层析是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析方法。当样品随流动相经过由凝胶组成的固定相时，分子量大的物质不能扩散进入凝胶颗粒内部，于是随流动相流经颗粒之间的狭窄空隙，首先洗脱出层析柱；分子量小的物质可以扩散进入凝胶颗粒内部，比分子量大的物质流经的截面积宽，流动速度慢，于是与分子量大的物质分离开来，最后被洗脱出来。即固定相的网孔对不同分子量的样品成分具有不同的阻滞作用，使之以不同的速度通过凝胶柱，从而达到分离的目的，凝胶过滤又因此得名“分子筛层析”和“凝胶排阻层析”。 适用于做凝胶过滤的材料有多种，主要有葡聚糖凝胶颗粒、琼脂糖凝胶颗粒和聚丙烯酰胺凝胶颗粒等。不论何种凝胶，其共同特点是化学性质稳定，不带电，与待分离物质吸附力很弱，不影响待分离物质的生物活性，样品得率可达100%。凝胶过滤尚有操作简便，凝胶柱不经特殊处理便可反复使用等特点，是近年来被广泛应用的生化技术之一。凝胶过滤除用于生物大分子的分离、分子量测定外，还可用于提纯、脱盐和复合物组分成分分析等。 三．离子交换层析 离子交换层析是以离子交换剂为固定相，利用固相的离子交换剂对液相样品中各种待分离离子的不同亲合力而将它们彼此分离的一种层析技术,多在柱中进行,故名“离子交换柱层析”。 离子交换剂是具有网状结构的复杂的有机高分子聚合物，网状结构的骨架部分一般很稳定，不溶于酸、碱和一般溶剂。在网状结构的骨架上有许多可被交换的酸性或碱性活性基团。这些带电荷的酸性或碱性基团与其母体以共价键相连，这些基团所吸引的阳离子（H+）或阴离子（OH-）可以与试样溶液中的阳离子或阴离子进行可逆的交换。根据可交换离子的性质将离子交换剂分为两大类：阳离子交换剂和阴离子交换剂；根据离子交换剂的化学本质，可将其分为离子交换树脂、离子交换纤维素和离子交换葡聚糖等多种。离子交换树脂是人工合成的高分子化合物，生化实验中所用的离子交换树脂多为交联聚苯乙烯衍生物，离子交换树脂多用于样品去离子，从废液中回收所需的离子和硬水的软化等。由于它可使不稳定的生物大分子变性，因此不适用于对生物样品进行分离。离子交换纤维素可用于生物大分子的分离，其缺点是分子形态不规则，孔隙不均一，对要求非常严格的实验尚不够满意。较为理想的离子交换剂是离子交换葡聚糖凝胶和离子交换琼脂糖凝胶，它们具有颗粒整齐，孔径均一等优点，往往得到较好的分离效果。根据各种离子交换剂所带酸性和碱性基团的不同和其解离H+或OH-