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选修3 《现代生物技术专题》精要知识点汇总 专题1 基因工程 （一）基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （二）基因工程的原理：基因重组 1.1 基因工程的基本工具 一、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） 1、来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 2、功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 3、结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 二、“分子缝合针”——DNA连接酶 1、两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别： E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。 2、与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 三、“分子运输车”——载体 1、载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 2、常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。 3、其它载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒 1.2 基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因主要是指： 编码蛋白质的结构基因 。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 3.从基因文库中获取目的基因 （1） 基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，这些受体菌称为这种生物的基因文库。 （2）基因组文库：如果一个基因文库含有某种生物的全部基因，这个基因文库就是该种生物的基因组文库。 （3）部分基因文库：如果一个基因文库含有某种生物的一部分基因，这个基因文库就是该种生物的部分基因文库。 4. PCR技术扩增目的基因 （1）什么是PCR？ PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。 （2）原理：DNA双链复制 （3）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。 第二步：基因表达载体的构建 (这一步是基因工程的核心) 1. 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 2. 组成：启动子＋目的基因＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段 ，它能使转录在所需要的地方停止下来。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞 1. 转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2. 常用的转化方法： （1）将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和 花粉管通道法等。 （2）将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。 （3）将目的基因导入微生物细胞： ① 早期的基因工程用原核生物作为受体细胞的原因：原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。 ② 应用最为广泛的微生物受体细胞是：大肠杆菌 ③ 大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：第一步，用Ca2+ 处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。第二步，将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 3. 重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。 第四步：目的基因的检测