蛋白电泳+WB剖析.docVIP

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1、基本原理1.1电泳 溶液中的带电颗粒在电场作用下的移动大致受到三方面影响：a、颗粒性质：体积大小及形状、实际电荷数、解离强度等。b、环境：电解质或缓冲液的浓度、离子强度、pH值、粘度和温度。c、应用电场性质：电场强度。不同带电颗粒在同一电场中泳动速度不同，常用“泳动度”或“迁移率”来表示。指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度：μ= v/E =d/t U/I = dI/Ut μ 迁移率，v 颗粒迁移速度（cm/s或min），E电场强度或电势梯度（V/cm），d颗粒移动距离（cm），I支持物的有效长度（cm），U是支持物两端实际电压（V），t是通电时间。颗粒的迁移率可通过测量d、I、U、t计算出。影响迁移率的因素：（1）带电颗粒的性质：净电荷多少、颗粒大小及形状。一般净电荷多，直径小而且近于球状，则泳动速度快，反之则慢。（2）电场强度（电位梯度）：指单位长度（cm）支持物体上的电位降，它对泳动度起着十分重要的作用。一般电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据电场强度可将电泳分为低压（常压）电泳100—500V，电场强度为2—10V/cm，分离时间需要数小时、数天或更长。高压电泳500—1000V，电场强度20—200V/cm，电泳时间短。有时仅需几分钟，主要用于氨基酸、肽、核苷酸。由于电压增高电流增大需要冷却装置。（3）溶液的PH：溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度。也决定物质所带净电荷的多少。对氨基酸、蛋白质等两性电解质而言，溶液PH值离等电点越远，颗粒所带净电荷越多，电泳速度越快。反之越慢。血清中：白蛋白pI 4.0；α2球蛋白 pI 5.06；β球蛋白 pI 5.1；γ球蛋白 pI 7.1。在pH 8.6的缓冲液中电泳时，都带负电荷，其泳动速度为：白蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白。为了利于分离蛋白质混合液，应选择一种使各种蛋白质所带电荷差异明显的pH值。（4）溶液的离子强度：在保持足够缓冲能力的前提下，离子强度要求最小。溶液离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。通常选择在0.05—0.1mol?L-1之间。缓冲溶液离子强度可通过下列公式计算：I=0.5ΣcZ2；I — 溶液的离子强度； c — 离子浓度； Z — 离子价数。如:0.154 mol?L-1的NaCl溶液的离子强度。I=0.5（0.154?12+0.154?12）=0.154（5）电渗作用：在有支持物的电泳时影响电泳的另一个重要因素是电渗作用。电渗作用：在电场中，溶液对固体支持物的相对移动。电渗作用根据支持介质的不同而产生不同程度和不同方向的电渗流动。因此电渗作用与电泳速度关系密切。 1.2蛋白电泳（结合多种资料加以总结，原创，欢迎指错！） 细菌酵母及细胞中含有大量蛋白质，具有不同的电荷、分子量及不同的形状。通常做wester时我们需要排除不同蛋白质之间的电荷、分子形状的差异，以使蛋白的迁移率仅和蛋白的分子量相关，结合蛋白MARKER和特异性的抗体，检测蛋白的成分。常用的消除电荷因素的试剂是强阴离子去污剂SDS。大量的SDS能够打断氢键和疏水键，按一定比例结合蛋白质，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身的负电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。而上样缓冲液中的还原剂巯基乙醇或DTT则能够破坏蛋白质二硫键，是蛋白的构想和形状发生改变，几乎全部成长椭圆状。因此，各蛋白再电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，仅与分子量有关。在此情况下，利用蛋白分子量marker及相应的特异性抗体即能检测目的蛋白。 1.3连续电泳和不连续电泳 早先用聚丙烯酸胺作为电泳的支持介质进行蛋白质的分离是用连续电泳系统。连续电泳是指电泳系统使用相同孔径的凝胶和相同缓冲系统的样品缓冲液、凝胶缓冲液和电极缓冲液，且pH值恒定，只是离子强度不同的区带电泳。使用这种电泳系统分离蛋白质，由于分子筛效应不明显，一般只用于分离组分比较简单的样品，且没有堆积胶的浓缩作用，分辨率较低，加样时必须加成一条极窄的带，以使样品能很好地分离。但如果高分辨不是实验目的，用这种方法制胶快而简单。它的另一个优点是在均一系统的电泳中，缓冲系统的精细组成是已知的，且pH是恒定的，这对分离pH敏感的化合物是有帮助的。l可以防止蛋白样品进入凝胶后，由于 pH变化而发生凝聚和沉B淀。另外它不需要像不连续缓冲系统一样去计算不同离子之间的迁移率变化，所以任何一种不同的酸和碱都能使用。不连续电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳。由于浓缩胶的堆积作用，可使样品（即使是稀样品）在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度）的凝胶上进行分离。由于不同孔径凝胶的分子筛作用，使不连续电泳的分辨率大大高于连续电泳。虽然不连续电泳