中药材DNA条形码分子鉴定指导原则.pdf

中药材DNA条形码分子鉴定指导原则 1. 背景 中药材存在多基原物种及同名异物、同物异名等问题，鉴于传统基原鉴定、 性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定方法存在局限性，为保证中药材临床应用安全、 准确、有效，有必要增加中药材DNA条形码分子鉴定法。 2. 定义及原理 DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列 来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。由于 DNA序列是由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T) 四种碱基以不同 顺序排列组成，因此一定长度DNA序列能够区分不同物种。 中药材DNA条形码分子鉴定是以ITS2为主体条形码序列鉴定中药材的方法 体系，其中植物类中药材选用ITS2为主体序列，psbA -trnH为辅助序列，动物类 中药材采用COI为主体序列，ITS2为辅助序列，符合中药材鉴定简单、精确的特 点，有明确的判断标准，能够实现对中药材及其基原物种的准确鉴定。本指导原 则用于规范中药材DNA条形码分子鉴定法，为其应用提供指导。 3. 适用范围 适用于中药材(包括药材、药材粉末及部分药材饮片)及基原物种的鉴定。 4. 方法流程 中药材DNA条形码分子鉴定法主要包括供试品处理、DNA提取、PCR扩增、 测序、序列拼接及结果判定，以下内容详细说明各流程中的主要原理及注意事项。 1）供试品处理 除特殊标明外，药材使用75%乙醇擦洗表面后晾干，称取10-100 mg备用。 具体见各药材项下。 2 ）DNA提取 DNA 的提取包括破碎细胞壁、释放DNA ，DNA 的分离和纯化，DNA 的浓缩、 沉淀与洗涤等基本步骤，目前常用试剂盒法，包括植物基因组DNA提取试剂盒 和动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒。 由于植物类中药材种类繁多，可根据所研究中药材的具体情况对提取方法加 以改进。植物细胞内储存了大量次生代谢产物，如多糖、多酚等，这些物质在提 取DNA 的过程中与DNA共沉淀，形成粘稠的胶状物难以溶解或产生褐变，严重 影响DNA提取的产量与质量，以及后续的PCR扩增实验。β-巯基乙醇是抗氧化剂， 在提取DNA过程中加入β-巯基乙醇，可以抑制氧化反应，避免褐化。PVP(聚乙 烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚， 减少DNA提取过程中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。因此 将PVP和β-巯基乙醇配合使用，能够有效地防止DNA提取过程中多酚及多糖的污 染。EDTA( 乙二胺四乙酸)螯合Mg2+或Mn2+ ，抑制DNase(DNA酶)活性；CTAB(十 六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与DNA形成复合 物。在天然状态下，DNA与蛋白质以DNP(DNA蛋白质复合物) 的形式存在，CTAB 可使细胞中的DNA 蛋白质复合物释放出来，该复合物在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl) 能充分溶解，存在于液相中。通过有机溶剂抽提，去除蛋白质、多糖、酚 类等杂质后加入乙醇沉淀即可使DNA分离出来。三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl) (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏。 根、根茎、茎木类、皮类 通常根和根茎组织中多酚、多糖含量高，在研磨 时多酚极易氧化成醌类，在纯化过程中很难去除，使DNA带有一定颜色，影响 后续的PCR反应，所以在提取根及根茎类药材DNA 时一定要注意多糖、多酚的去 除。提取根及根茎类药材DNA 时水浴时间一般为90分钟，对于质地坚硬的根、 根茎类和茎木类药材，可以采用延长水浴时间，如56 ℃水浴过夜，使得DNA充 分释放到缓冲溶液中。此外，根茎类药材由于富含纤维和贮藏物质，需较多样品 量才能提取到足量DNA ，可用大体积离心管(5 mL或15 mL)抽提。皮类中药材组 织中富含薄壁组织和纤维等，加液氮不易研磨成细粉，需适当增加样品量，同时 应增加β-巯基乙醇和PVP 的使用量。 叶、花、全草类 该类药材采用试剂盒一般都能成功提取其DNA ，对于保存 时间较久的叶、花、全草类药材可适当增加水浴时间，同时适当降低水浴温度， 如56℃水浴过夜等。 果实、种子类 果实及种子类中药材中多富含油脂，研磨时易被氧化，且易 粘着在研钵壁上，损失较大，提取时需增加样品量。另外，对研磨后的材料可用 丙酮浸提，去除脂溶性酚类化合物。 动物药材 肌肉类动物药材如海龙、蛇类、蛤蚧等，需进行紫外杀菌处理， 并且需要充分磨碎。含有脂类较多的动物内脏器官如