实验11免疫电泳.doc

免疫电泳技术 将可溶性抗原（如人血清蛋白） 与相应抗体（如兔抗人血清的抗体）混合，当两者比例合适并有电解质（如氯化钠、磷酸盐等）存在时，即有抗原-抗体复合物的出现，此为沉淀反应。如以琼脂凝胶为支持介质，则在凝胶中出现可见的沉淀线、沉淀弧或沉淀峰。根据沉淀的出现与否及沉淀量的多寡，可定性、定量地检测出样品中抗原或抗体的存在和含量，免疫学的一些测定方法即基于此特性。 抗原与抗体的结合在沉淀反应中，呈一定的分子比例。不同抗原和抗体之间的分子比例是不同的，但只有在分子比例合适时，才出现可见的沉淀。所以沉淀能否出现并不完全反映抗原和抗体是否存在和发生结合。抗原结合多个抗体分子，称抗原为多价；抗体一般只能结合两个抗原分子（IgM类抗体分子通常可以结合5个抗原分子）的抗原决定法簇，故为二价。只有在彼此的结合价饱和时，才出现大量的抗原-抗体复合物沉淀。 当抗原与抗体的比例合适时，即二者结合价彼此饱和，就可形成网状结构的大分子抗原-抗体复合物沉淀，称为等价带。若比例不合适时，抗体或抗原过量，则虽有抗原、抗体的结合，但不能大量形成网状结构的大分子复合物，沉淀量很少，甚至不出现沉淀。在抗原、抗体数量关系曲线中，抗体过剩区域称为抗体过剩带，抗原过剩区域称为抗原过剩带。如图1所示，在等价带的反应液中加入过量的抗原或抗体，沉淀复合物就会有部分溶解，甚至全部溶解的现象。这是由于新加入的抗原或抗体竞争地结合相应的抗体或抗原，使网状大分子结构破坏，形成小分子复合物，致使沉淀出现溶解，沉淀量减少甚至完全消失。在沉淀反应中，由于抗原过量而不出现沉淀的现象，称为前带现象。此时不能误认为无沉淀就是无抗原存在，为了检测就必须稀释抗原。抗体过量时，称为后带现象，同理需要稀释抗体进行检测。 图1的位置 抗原与抗体的结合是依赖于两者分子结构的互补性，故其特异性高。这种结合也是相当稳定的。在一定条件下（过酸、过碱或浓盐存在下），二者可以分开，即结合是可逆的。解离后的抗原、抗体的活性一般保持不变。 双向免疫扩散测定法 原理 双向扩散法(double diffusion)又称琼脂扩散法，是利用琼脂凝胶为介质的一种沉淀反应。琼脂或琼脂糖凝胶是多孔的网状结构，大分子物质可以自由通过，这种分子的扩散作用可使分别处于两处的抗原和相应的抗体通过扩散相遇，形成抗原-抗体复合物，比例合适时出现沉淀。由于凝胶透明度高，可直接观察到复合物的沉淀线（弧）。沉淀线（弧）的特征与位置取决于抗原相对分子质量的大小，分子结构、扩散系数和浓度等因素。当抗原、抗体存在多种系统时，会出现多种沉淀线（弧）。依据沉淀线（弧）可以定性抗原，诊断疾病。此法操作简单，灵敏度高，是最为常用的免疫学测定抗原和抗血清效价的方法。 操作方法 制备离子琼脂板 用10mL量筒，量取4mL融化的巴比妥离子琼脂，倒在玻璃片上，待琼脂凝固后，按图2所示的方法打孔。 图2的位置 打空后用注射器针头将孔内琼脂挑出，在酒精灯上烘烤背面，使琼脂与玻璃板贴紧。 稀释抗原和抗体 采用2倍连续稀释法。将抗原与抗体按2的等比级数即20、21、22、23…方式连续稀释。方法是取试管数支，各加入稀释液（生理盐水）一份，在于第一管中加入抗原或抗体一份，用吹吸法混匀后，吸出一份加入第二管中,如此依次稀释到最后一管。其稀释倍数依次是：2，4，8…。 加样 将稀释好的抗原或抗体依次加入外周孔中，中心孔加入相应的抗体或抗原，加入的量以平琼脂表面为度或用微量进样器定量加入。加样后置大培养皿内（皿内放有湿滤纸或湿纱布以维持湿度）。盖好皿盖，于24—37℃温箱内保温24—48小时。扩散后可出现清晰的沉淀线，以出现沉淀线的抗体稀释倍数最高的一孔为被测抗体的效价。 染色及保存 经染色后可提高沉淀线的可见度。 漂洗琼脂板：将琼脂板置生理盐水中浸泡两天，每天更换生理盐水2次以洗 去未结合的抗原或抗体。生理盐水浸泡后，更换蒸馏水浸泡1天，换水2次以除去盐分。琼脂板较脆易破，操作需小心。 干燥：取出琼脂板，覆盖滤纸片，于室温自然干燥或吹干、烘干。 染色：将琼脂板置于染色剂（0.05%氨基黑10B）中浸泡，约5分钟（*注意观察染色深度），再加5%的乙酸浸泡以脱去背景颜色为度。脱色后滴加少量5%的甘油至琼脂板上，置室温干燥保存。如欲取下琼脂薄膜，则需在干燥前浸泡在10%的甘油中（或在染色剂、脱色剂中加10%甘油），烘干后轻轻去下薄膜。 本实验用琼脂糖效果最好，琼脂粉次之，琼脂所含杂质较多时，制出的琼脂凝胶板透明度较差，影响沉