原创力文档- 1、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。。
- 2、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
- 4、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
- 5、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 6、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 7、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
(pH7.4)、0.1mmolL苯甲基磺酰氟；
PriCells: 原代细胞核孔复合物的分离
试剂和器材：
1. 肝素；
2. 苯甲基磺酰氟（PMSF）（溶于乙醇中配制成1mol/L储存液）；
3. 纯化的核膜；
4. 提取缓冲液（EB）：含1%（体积分数）TritonX-100的10mmol/LTris-HCl，
（pH7.4）、0.1mmol/L苯甲基磺酰氟；
5. Tris缓冲液：2mmol/LTris-HCl、pH7.4，10mmol/LTris-HCl、pH7.4；
6. 梯度溶液：0.25mol/L 蔗糖溶液和 1.5mol/L 蔗糖溶液溶于 10mmol/L
Tris-HCl，pH7.4；
7. 所有溶液须含0.1mmol/L苯甲基磺酰氟；
8. 梯度收集器；
9. 高速离心机，配有固定角转子和离心管；
10.超速离心机，配有固定角和吊桶式转子、离心管；
11.超声发生器（探针型，带有定时器）；
TM
12.双室梯度仪或者GradientMaster ；
实验方法：
1. 采用提取缓冲液，4℃抽提原代细胞核膜30min；
2. 20000g离心30min，松散地沉淀核孔复合物薄片。用2mmol/LTris-HCl、
（pH7.4）小心重悬沉淀，再次离心；
3. 用10mmol/L的Tris-HCl（pH7.4）小体积重悬沉淀（如1ml），并在冰浴
上超声处理。为防止样品产热，超声过程中重复短时间处理（如10s），
中间间隔冷却；
4. 通过制备负染标本，如用20g/L钼酸铵（pH7.0）或50g/L钼酸铵-1g/L
海藻糖（pH7.0）进行电镜分析，及时监测核膜的破裂以及核孔复合物的
释放。如果必要的话，继续超声处理；
5. 将样品加于0.25—1.5mol/L蔗糖-10mmol/LTris-HCl（pH7.4）线性密度
梯度溶液上，4℃、约60000g离心1—2h；
6. 从蔗糖梯度溶液中部分收集；
7. 采用负染电镜检测收集各成分内容物，以确定核孔复合物沉淀在蔗糖梯度
溶液中的位置，并进行完整性分析；
8. 对梯度成分进行SDS，检测蛋白分离情况；
PriCells提供：
1. 各种原代细胞特制基础培养基；
2. 各种原代细胞培养特制添加剂；
3. 原代细胞分离试剂盒；
4. 原代细胞鉴定试剂盒；
5. 原代细胞转染试剂盒；
6. 原代细胞总蛋白质抽提物；
7. 原代细胞总RNA；
8. 原代细胞总DNA；
文档评论（0）