胡萝卜组培实验.ppt

【实验目的】 熟悉植物组织培养流程 了解培养基的配制方法 掌握无菌操作技术 【实验原理】 植物组织培养是指植物的任何器官、 组织或 细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养 物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使 其生长、分化并形成完整植株的过程。其理论依 据是植物细胞具有全能性。 【实验材料及仪器】 实验材料：胡萝卜 实验器材：高压灭菌锅，超净工作台，电子天平，酒精灯， 三角瓶，镊子，剪刀， 手术刀，烧杯 实验药品：配制MS培养基的各种试剂，蔗糖，琼脂，0.1%升汞（本实验采用次氯酸钠），2,4-D，6-BA，NaOH，HCl等 【实验步骤】 MS培养基的配制 取1000ml烧杯，分别取各种成分的母液100ml，加入烧杯，称取蔗糖30g，琼脂6.5g，按照需要的浓度分别加入各种植物生长调节剂（2 ,4 - D 浓度1mg/L+6-BA浓度0.5mg/L），加水至800ml。加热使琼脂溶解，定容至1000ml，用10％NaOH调节pH至5.6~5.8。 培养基及材料灭菌 将配好的培养基迅速分装至50ml三角瓶中，用棉花塞好，用牛皮纸或报纸包扎（本实验采用封口膜封口）。放入高压灭菌锅中，121℃、灭菌20min。 培养基及材料灭菌 无菌水：用500mL三角瓶，加入约300mL蒸馏水，封口膜封口， 121℃、灭菌20min。 无菌滤纸、无菌瓷砖：将实验所需滤纸、瓷砖等用包装包好， 121℃、灭菌20min。 剪刀、镊子、解剖刀灭菌：可直接在酒精灯上燃烧进行灭菌。 超净台上操作 （１）用酒精棉球擦手，然后点燃废酒精棉球擦拭超净台工作台面。取出一张无菌滤纸，放在面前。将无菌瓷砖打开包装，置于无菌滤纸旁边。 （２）用酒精灯火焰烧灼刀柄、刀片、镊子等，置于瓷砖上冷却后置于无菌滤纸上。 （３）用无菌的镊子夹取一条无菌的胡萝卜，用无菌解剖刀把胡萝卜形成层部分切成1cm3小块。 （4）取一瓶培养基，除去橡皮筋，揭开封口膜，把培养基放在紧靠酒精灯火焰无菌区的后方。 （5）用无菌镊子夹取胡萝卜小块，接种于MS培养基上，每瓶接种6块外植体。注意无菌操作。 （６）盖好封口膜，缠好皮筋，用记号笔在培养瓶封口膜上写好班级姓名。 放入培养箱，25℃暗培养7-10天后观察记录。 【注意事项】 1、实验所使用的器材要严格灭菌，注意无菌操作，避免因 染菌导致实验失败； 2、配制贮存母液时，要计算好各种成分扩大倍数后逐次加入，在第一种成分完全溶解后再加入第二种成分，切忌“一锅煮”。有机成分配好后要装入棕色瓶中在冰箱内保存，其它三种母液可在常温下保存，但最多不能超过一个月； 3、pH值对培养基的硬度有影响，pH过高培养基变硬，pH过低培养基不能凝固，所以要调整好培养基的pH值； 4、材料消毒时不要在酒精中停留过长时间； 5、接种后进行培养时，为确保实验成功，可以首先进行7-10d的暗培养，然后再进行光照培养。 * * 植物组织培养实验  1.MS培养基母液的配制 按照表1配制MS培养基母液 表1. MS基本培养基的配制 mg/L 1650 1900 440 170 370 mg/L(100×) 165000 190000 44000 17000 37000 大量元素 NH4NO3 KNO3 CaCl2·H2O KH2PO4 MgSO4·7H2O MS培养基 母液 成分 22.3 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 2230 860 620 83 25 2.5 2.5 MnSO4·4H2O ZnSO4·4H2O H3BO3 KI Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O mg/L mg/L(100×) 微量元素 mg/L 2.0 0.4 0.5 0.5 100 mg/L(100×) 200 40 50 50 10000 有机物质 甘氨酸 硫胺素 烟酸 盐酸吡哆醇 肌醇 mg/L 37.25 27.85 mg/L(100×) 3725 2785 铁盐 Na2EDTA FeSO4·7H2O 正式接种前30min，打开超净工作台上的紫外灯和风机，30min后接种； 上超净台的第一件事是关闭紫外灯并打开照明灯； 把解剖刀、镊子、解剖针等器械浸泡在75％酒精中； 点燃酒精灯； 用75％的酒精棉球擦拭双手； 外植体的消毒：将胡萝卜用自来水充分洗净削去外皮切成10cm 段,置于超净工作台上用75 %酒精浸洗30s ,无菌水冲洗2～3 次,再用2.5%次氯酸钠溶液处理30min ,无菌水冲洗3～5次。