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实验十乳酸脱氢活性的检测
实验十、 乳酸脱氢酶活力测定 目 的 要 求 (1) 了解乳酸脱氢酶活性测定原理。 (2) 学习用比色法测定酶活性的方法。 实 验 原 理 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase简称LDH)广泛存在于生物细胞内,是糖代谢酵解途径的关键酶之一,可催化下列可逆反应。 LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多,其中紫外分光光度法更为简单、快速。鉴于NADH, NAD+ 在340nm及260nm 处有各自的最大吸收峰,因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改变,定量测定酶活力,如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、甘油-3-3磷酸脱氢酶等。 本实验测乳酸脱氢酶活力,是在一定条件下,向含丙酮酸及NADH的溶液中,加入一定量乳酸脱氢酶提取液,观察NADH在反应过程中340 nm 处光吸收减少值,减少越多,则LDH活力越高。 其活力单位定义是:在25℃,pH7.5条件下每分钟A340下降值为1.0的酶量为1个单位。 LDH活力测定 预先将丙酮酸钠溶液及NADH溶液放在25℃水浴中预热。取2只石英比色杯,在1只比色杯中加入0.1mol/L pH 7.5磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液3mL,置于紫外分光光度计中,在340nm处将光吸收调节至零;另一只比色杯用于测定LDH活力,依次加入丙酮酸钠溶液2.9mL, NADH溶液0.1mL,加盖摇匀后,测定340 nm光吸收值(A)。取出比色杯加入经稀释的酶液10mL,立即计时,摇匀后,每隔0.5min 测A340,连续测定3min,以 A对时间作图,取反应最初线性部分,计算每分钟A340减少值。 数据处理 计算每毫升组织提取液中LDH活力单位: LDH活力单位(U)/mL 提取液= 注意事项 (1)实验材料应尽量新鲜,如取材后不立即用,则应贮存在-20℃冰箱。 (2)酶液的稀释度及加入量应控制每分钟A340下降值在0.1-0.2之间,以减少实验误差。 (3)NADH溶液应在临用前配制。 思考题 1.简述用紫外分光光度法测定以NAD+为辅酶的各种脱氢酶测定原理。 * 注:稀释倍数为5倍 *
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