抗条纹叶枯病转基因水稻的培育RNA干扰机理.ppt

抗条纹叶枯病转基因水稻的培育  ——RNA干扰机理 专业：食品科学与工程学院 班级：质检1002班 指导教师：朴美子 姓名：白杨 学号大纲 一丶原理 二丶方法步骤 三丶结语 一丶原理 枯叶病水稻 水稻条纹叶枯病毒RSV是纤细病毒属的代表成员，由介体灰飞虱以持久性方式经卵传播。RSV的寄主范围很广泛，但在水稻上引起的症状最为严重。水稻是我国主要的粮食作物之一，保障水稻的产量及人民的生产生活势在必行。 在提高植物抗病性方面，与其它基因工程技术相比，RNA干扰作为一种新兴的基因阻断技术具有绝对的优势。 分子生物学研究表明，水稻条纹叶枯病病毒即RSV的基因组由4个独立的单链RNA大分子组成，按照分子量大小分别命名为RNA1～RNA4，包含了7个开放阅读框。 根据RNA干扰的原理，该表达载体导入植物体后如遇到RSV的侵染，将产生使RSV的单链RNA沉默的结果，从而使其无法表达而丧失致病性。 一丶原理 二丶方法步骤 1.五个RSV干扰片段的克隆及酶切鉴定 以感染条纹叶枯病毒的水稻叶片总RNA反转录合成的第一链cDNA为模板，经五对水稻RSV基因特异引物进行RT-PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，共得到OsRSV1、OsRSV2、OsRSV3、OsRSV4、OsRSV5五条片段，大小分别为1000bp、265bp、247bp、193bp和550bp，条带大小分别与预期目的条带一致，产物经回收并测序分析，证明为目的片段 二丶方法步骤 2.pUC19-RNAi-OsRSV（1-5）系列干扰载体的构建 干扰载体pUC19-RNAi中内含子的两端各含有一对同尾酶，即BamH I和Bgl II以及Sal I和Xho I，且它们方向正好相反，这样就可以先通过BamH I和Sal I分别将载体pMD18T-OsRSV中的五个干扰片段双酶切下来，正向连入pUC19-RNAi载体，然后再用Bgl II和Xho I双酶切此干扰载体，将五个干扰片段反向连入进去，这样每个病毒片段对应的RNAi载体就构建成功了 二丶方法步骤 3.pCA1300–Ubi-RNAi-OsRSV（1-5）系列植物双元表达载体的构建. 经改造的pCambia1300 表达载体添加了玉米泛素（Ubi）启动子，由它来启动目的基因的表达，同时下游插入了由组成型35S 启动子驱动的bar 基因作为选择标记， 重新命名为pCA1300-Ubi 。将上述构建好的系列干扰载体pUC19-RNAi-OsRSV（1-5）中的五个正反向RSV 干扰片段经Pst I 单酶切克隆入pCA1300-Ubi 载体中，重命名为pCA1300–Ubi-RNAi-OsRSV（1-5）。我们以一个水稻RSV 片段OsRSV1 为例， 构建成功的表达载体图谱将构建好的五个系列双元表达载体 pCA1300–Ubi-RNAi-OsRSV（1-5）分别经Pst I 酶切并电泳鉴定，产物大小均分别与预期相符合，证明载体构建成功 二丶方法步骤 4农杆菌介导的水稻转化 将鉴定好的含目的干扰片段的系列双元植物表达载体pCA1300–Ubi-RNAi-OsRSV（1-5）分别转入农杆菌LBA4404中，以转化的农杆菌菌液作为模板进行PCR扩增，鉴定目的片段是否成功转入。农杆菌菌液PCR鉴定结果如图（A、B、C、D、E） 二丶方法步骤 二丶方法步骤 5.转基因植株的鉴定 通过农杆菌介导的遗传转化，五个条纹叶枯病毒的cDNA片段的转化植株分别转OsRSV1：4株；转OsRSV2：6株；转OsRSV3：5株；转OsRSV4：7株；转OsRSV5：11株。对转基因植株进行分子鉴定，即提取各转化植株的基因组DNA，以各自的基因特异性引物进行PCR扩增。 二丶方法步骤 5.转基因植株的鉴定 结果显示，4株转OsRSV1的植株中只有第2株获得了与阳性对照大小一致的约为1000bp的条带，确定为转基因阳性株系（如图A），转化效率为25%；6株转OsRSV2的植株中第1、3、4、5、6株获得了与阳性对照大小一致的约为265bp的条带，确定为转基因阳性株系（如图B），转化效率为83%；5株转OsRSV3的植株中第1、3株获得了与阳性对照大小一致的约为247bp的条带，确定为转基因阳性株系（如图C），转化效率为40%；7株转化OsRSV4的植株中仅第3株获得了与阳性对照大小一致的约为193bp的条带，确定为转基因阳性株系（如图D），转化效率为14%；11株转化OsRSV5的植株