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4.3 离子交换层析 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是利用与固定相偶联的离子交换基团和流动相中的各组分的离子进行可逆交换而进行分离的一种层析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。1935年，Adams和Holmes通过酚、甲醛和磺酸缩聚成不容性的树脂，这就是第一个人工合成的离子交换树脂。离子交换层析介质就是在离子交换树脂（载体）上引入具有活性的离子交换基团，这些基团能与溶液中有相同电荷的基团进行交换反应。此法主要应用于分离小分子物质，如氨基酸、多肽、糖类、核苷酸、有机酸等的分离纯化。 4.3.1 基本原理 离子交换层析是依据混合样品中各种离子或离子化合物与离子交换树脂的可交换离子之间的交换程度不同而进行分离纯化的。偶联有可交换离子的树脂称为离子交换剂，它由三个部分组成：基质、电荷基团和可交换离子。电荷基团与基质共价结合后，形成一个带电体，再与可交换离子结合，成为完整的离子交换剂。可交换离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。可交换离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；可交换离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。 离子交换反应可以表示为： 阳离子： R—O?—X? + Y? ←→ R—O?—Y? + X? 阴离子： R—O?—X? + Y? ←→ R—O?—Y? + X? 其中R代表离子交换剂的基质，O? 和O? 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与基质共价结合的电荷基团，X ? 和X?分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的可交换离子，Y? 和Y?分别代表溶液中的离子基团。 离子交换层析主要是离子交换剂与溶液中离子或离子化合物以离子交换方式进行，过程是可逆的。由于离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的结合力，也就是说，离子交换剂对各离子的排斥和阻滞作用不同，从而引起各离子在柱内的流速差异，逐渐发生分离，最终分别流出层析柱。 那么，有哪些因素可以影响到离子交换剂与各种离子之间的结合能力呢？第一，随着离子浓度的增加，离子交换剂对其的结合力也显著提高，这常常用于离子层析柱的处理及再生；第二，离子交换剂与离子的结合力与其所带的电荷量成正比，而生物分子带电荷与否，或带什么样的电荷，主要决定于缓冲液的pH值和生物分子的pI值，当pHpI时，带负电荷，当pHpI时，带正电荷，而且，pH与pI之间的差距越大，它们所带的净电荷的量越大；第三，离子的原子序数越高，其半径越小，结合力也越大。当然，离子交换层析作为柱层析的一种，不可避免的也要受到缓冲液离子强度、柱温、流速等条件的影响。 下面以含有氨基的层析为例，说明之。当带有氨基的阴离子交换树脂在高pH值时，树脂不带电，而在低pH值时，可与水溶液中的可交换离子OH?弱结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团与可交换离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如选用离子强度或pH的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度或pH的增大，洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置换出来，随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来，而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度或pH才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来，从而达到分离目的。 4.3.2 离子交换剂的种类和性质 根据与基质共价结合的电荷基团的性质，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。阳离子交换剂的电荷基团带负电，可以交换阳离子物质。根据电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型和弱酸型三类。它们的区别在于它们电荷基团完全解离的pH范围，强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离，而弱酸型完全解离的pH范围则较小，如羧甲基在pH小于6时就失去了交换能力。一般结合磺酸基团[R-SO3H]，如磺酸甲基（简写为SM）、磺酸乙基（SE）等为强酸型离子交换剂，结合磷酸基团[R-PO3H2]和亚磷酸基团[R-POH2]为中等酸型离子交换剂，结合酚羟基[R-苯环-OH]或羧基[R-COOH]，如羧甲基（CM）为弱酸型离子交换剂。一般来讲强酸型离子交换剂对H+离子的结合力比Na+离子小，弱酸型离子交换剂对H+离子的结合力比Na+离子大。 阴离子交换剂的电荷基团带正电，可以交换阴离子物质。同样根据电荷基团的解离度不同，可以分为强碱型、中等碱型和弱碱型三类。一般结合季胺基团