苏木素与胰蛋白酶作用的性质研究.docVIP

　　苏木素与胰蛋白酶作用的性质研究 作者：黄忠林， 宋九华， 王应红 【摘要】 　　目的认识苏木素对胰蛋白酶作用活性的影响及苏木素对胰蛋白酶作用的荧光性质。方法用酶活性法观察苏木素对胰蛋白酶活性的影响；用紫外光谱和荧光光谱研究苏木素对胰蛋白酶作用的光谱性质。结果苏木素对胰蛋白酶活性可产生竞争性抑制，抑制剂常数K1=6.13×10-5 mol/L；苏木素对胰蛋白酶的荧光猝灭效应为静态猝灭；苏木素与胰蛋白酶之间的作用力主要表现为氢键和范德华力。结论苏木素可使胰蛋白酶分子中的色氨酸所处环境的疏水性增强，使胰蛋白酶分子构象发生变化。 【关键词】 苏木素 胰蛋白酶 荧光光谱 紫外光谱 酶活性 中药苏木的主要成分苏木素(Haematorylin)是组织、病理实验室中最常用的染色剂，可用于细胞核染色［1］。苏木素具有收缩血管、中枢抑制及抗炎等作用，具有行血、破淤、消肿、止痛的功效［2］。胰蛋白酶(trypsin)是人和动物肠道中一种重要的蛋白水解酶，从该酶被发现以来，人们对其进行了一定的研究，如用胰蛋白酶为催化剂对蛋白质进行降解的研究［3～5］。药物对胰蛋白酶作用的性质［6］及苏木素与DNA作用的性质的研究已引起重视［7］。本文主要通过紫外和荧光光谱法研究苏木素与胰蛋白酶作用的性质，从而获得苏木素与胰蛋白酶作用时结构变化、所处微环境等信息，探讨苏木素与胰蛋白酶相互作用的机制，并对苏木素与胰蛋白酶作用活性的影响也进行了研究。 　　 1 器材 　　1.1 仪器荧光分光光度计，美国Cary Eclipse（瓦里安）产品；双光束紫外可见分光光度计TU－1901，北京普析产品；pH－3C型酸度计，上海精密 科学 仪器有限公司产品。 　　1.2 药品牛胰蛋白酶（生化试剂），上海海洋生物技术有限公司产品；苏木素（生物染色剂BS），成都科龙化工试剂厂产品；硼酸（分析纯 ），成都科龙化工试剂厂产品。 　　 2 方法 　　2.1 苏木素对胰蛋白酶活性影响在恒温水浴箱中将酪蛋白、胰蛋白酶和苏木素预热，按酶活性的测定方法，在胰蛋白酶与酪蛋白的酶解反应体系中加入不同体积的苏木素溶液，测定苏木素对酶活性的影响。胰蛋白酶活性及抑制常数测定参照 　　3.4 荧光猝灭常数及猝灭机理 　　3.4.1 苏木素对胰蛋白酶的猝灭效应一般情况下，可依据不同温度下的结果区别是动态猝灭，还是静态猝灭。对于动态猝灭，随着温度升高，将增加离子有效碰撞的数目，加剧 电子 的转移，使荧光物质的猝灭常数随温度的升高而增大。而对于静态猝灭则温度升高将降低复合物的稳定性，使猝灭常数减小。本文以相同的实验条件，分别测定了在20，25℃ 下胰蛋白酶的荧光猝灭光谱，以［F0/F－1］对［C］作Stern－Volmer图见图3。从图3可以看出苏木素在温度低于25℃时猝灭常数随温度的升高而降低，即符合静态猝灭机理。 当猝灭体分子和荧光物质分子之间形成新的复合物而发生静态猝灭时，服从Line所得到的同步荧光光谱图仅显示的是酪氨酸残基的荧光，(b)△λ＝60 nm时仅表现出色氨酸残基的荧光，由图5可以看出在此实验条件下，酪氨酸和色氨酸残基荧光同时被猝灭，使其荧光强度下降，酪氨酸残基的最大发射波长没有发生改变，但色氨酸残基的最大发射波长发生了蓝移，表明色氨酸基所处环境的疏水性增强，引起了胰蛋白酶的构象变化。 　 　　 4 结论 苏木素对胰蛋白酶活性可产生非竞争性抑制，抑制剂常数Ki=6.13×10-5mol/L；苏木素对胰蛋白酶的荧光猝灭效应为静态猝灭，说明苏木素能与胰蛋白酶形成复合物；苏木素与胰蛋白酶之间的作用力主要表现为氢键和范德华力；苏木素与胰蛋白酶可发生作用，改变了胰蛋白酶的构象，而色氨酸所处环境的疏水性增强显著。 【 参考