蔗糖酶理论讲授—2012.8.13.pptVIP

凝胶层析的基本原理 凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，其原理是分子筛效应，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。 在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。 1、影响酶促反应速度的因素 pH值 温度 酶浓度 底物浓度 激活剂 抑制剂 使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。 能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。 酶的抑制剂一般具备两个方面的特点： 在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。 能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体。 不可逆抑制 抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。 可逆抑制 抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。 根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为两类（竞争性抑制和非竞争性抑制) 某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。 竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。 加入竞争性抑制剂后，Km 变大，酶促反应Vmax不变。 酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与酶活性中心结合，所以称为非竞争性抑制剂。 如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。 加入非竞争性抑制剂后，Km 不变，但由于Vmax减小，所以酶促反应速度也下降了。 5、蔗糖酶米氏常数的测定（本实验） 1）将离子交换柱层析得的E3稀释(pH4.6 HAC缓冲液)至30U/mL，共16ml。 2）取试管8支，按0—7编号，0为对照管。 3）按P146页表将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35℃水浴中保温（使温度平衡，以下同）10min。 4）取16ml酶液，放入同一水浴中保温约10min。 5）于各管中依次按同样时间间隔加入已保温过的酶液2ml，记时，立即摇匀。在35℃水浴中准确反应3min。 6）按同样次序和时间间隔，加入0.5ml的1mol/L NaOH，摇匀，终止反应。 7）吸取反应混合物0.5ml，加入盛有3ml DNS试剂和1.5ml去离子水的血糖管中，放入沸水中加热5min，冷却后稀释定容至25ml，摇匀后，测定A540值 7、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 * 三、实验步骤及原理 1、蔗糖酶的提取 2、蔗糖酶的纯化 3、各纯化级别蔗糖酶的活性测定 4、各纯化级别蔗糖酶的蛋白质含量测定 5、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响 6、蔗糖酶酶促反应动力学研究 7、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量 1、蔗糖酶的提取 (细胞破壁) 自溶法破壁（本实验） 干酵母粉 溶于蒸馏水 乙酸钠 乙酸乙酯 35℃恒温 搅拌40分钟 35℃恒温过夜 补加蒸馏水 搅拌均匀，成糊状 离心 弃沉淀及脂层 E1 记录生产厂家和批号 用硫酸纸封严（过夜） E1 用稀 HAC 调 pH至4.5 乙醇分级 (32%乙醇饱和度)Ι 离心，取上清 乙醇分级 (47.5%乙醇饱和度) Ⅱ 离心，取沉淀 透析 磷酸缓冲液5mmol/L pH6.0 过夜 离心，取上清 E2 E2 E3 DEAE-52 离子交换层析 E3 E4 Sephadex-G100 凝胶层析 2、蔗糖酶的纯化 1. 酶的蛋白属性； 2. 调节酶溶解度的方法； 有机溶剂分级沉淀 3. 根据酶分子大小、形状不同的分离方法； 透析、凝胶层析 4. 根据酶分子电荷性质的分离方法； 离子交换层析 5. 根据酶分子专一性结合的方法; 酶的纯化方法 2. 调节酶溶解度的方法； 酶的纯化方法 （1）改变离子强度； 盐溶 / 盐析 硫酸铵分级沉淀（反抽提法） （2）改变pH或温度； （3）改变介电常数； 有机溶剂分级沉淀：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。 亲水性有机溶剂加入溶液后降低介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了表面水化膜的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集。 有机溶剂分级沉淀操作条件的控制 溶剂选择 常用的溶