钙调蛋白的分离提纯精要.pptVIP

* * * 讲解人 ： 郭智妍 已知某蛋白的分子量约为17 kDa，等电点3.9~4.1，它能耐一定的高温，在90 ?C加热3~4 min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体内酶的激活剂。请设计一个从脑组织中提取和分离纯化该蛋白的实验方案，要求写出具体的步骤和理由以及检测方法。 1、钙调蛋白 2、酸性蛋白质 3、加热变性沉淀法 4、SDS阴离子表面活性剂 02 01 材料的选择 和预处理 03 04 精细纯化 05 检测鉴定 细胞破碎 目标物的提取与分离（粗提取） 01 材料的选择和预处理 一、 材料的选择和预处理 材料的选择 预处理 大鼠脑组织 将切取的组织用4℃预冷的0.01mol/l的PBS漂洗去血渍，再用滤纸吸干残留的PBS（磷酸盐缓冲液） 一、 材料的选择和预处理 缓冲液 PH：一般来说，提取蛋白质时应在远离其pI的pH条件下进行，以不危及蛋白质的化学属性。 蛋白酶抑制剂：动物组织含有多种蛋白酶，它们会使所需的蛋白质发生降解，在有些情况下还会改变它的活性。用蛋白酶抑制剂是很重要的。 金属离子抑制剂：组织中有不同的金属离子，需利用螯合物（EDTA）与提取物中的蛋白质及其他化合物的相互作用来去除这些金属阳离子。 02 细胞破碎 二、 细胞破碎 机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有： ①玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎） ②高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破裂。 物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 Ⅰ反复冻融法 Ⅱ冷热变替法 Ⅲ超声波法 化学及生物化学方法 二、 细胞破碎 匀浆法 匀浆法（属于机械破碎）是指将适当溶媒加入到新鲜的生物组织中，在匀浆搅拌刀的强力作用下，细胞液中的活性成分迅速溶出到溶媒中的过程。具有成分提取率高，能耗低，提取不加温，提取速度快等优点。 03 目标物的提取与分离 三、 目标物的提取 匀浆液在4℃下14 500 r/min离心30 min,收集上清液。沉淀物再用上述方法重新提取一次,合并上清液。 差速离心法 三、 目标物的分离 盐析沉淀法 利用钙调蛋白在中性或略碱性pH及不存在钙离子的条件下，钙调蛋白高度可溶的特性。 等电点沉淀法 在等电点时，蛋白质在水溶液中的溶解度最低，会沉淀出来。 加热变性沉淀法 钙调蛋白能够耐一定的高温，而其他蛋白在高温下会因加热变性而凝固 三、 目标物的分离 盐析沉淀法 首先，用pH8.0条件下的硫酸铵溶液，把大部分蛋白质沉淀出来，而同时把钙调蛋白留在上清液中。在中性或略碱性pH及不存在钙离子的条件下，钙调蛋白是高度可溶的。甚至在高盐浓度（60%饱和硫酸铵）下，pH8.0时，该蛋白也能留在溶液中。 等电点沉淀法 用50%硫酸将溶液的pH调至pH4.0~4.1之间。这可降低pH而不改变溶液中的主要阴离子即硫酸根离子。需要加的酸体积很小，故可很快降低pH，避免其他蛋白质在中间pH下沉出。 加热变性沉淀法 加热变性沉淀法：将蛋白质溶于少量缓冲液（20mM Tris-HCl，pH=7.0, 1mM咪唑，1 mMMgAC2,10uM CaCl2)中，加入少量蛋白酶抑制剂配成溶液，调pH=8.0，置于90℃水浴中煮沸3—4分钟，冰水浴冷却后离心，获取上清液。 04 精细纯化 四、 精细纯化 透析： 方法：将上清液在纤维素透析袋中透析。 原理是：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。 目的：去除蛋白液中的配体离子。 离子交换层析： 前提：钙调蛋白是一种强酸性蛋白因而在中性或微碱性pH条件下带有大量净负电荷。 原理：在低离子强度条件下，钙调蛋白会与带正电荷的树脂结合，而许多等电点较高的蛋白质则不结合。然后，改变条件将结合的蛋白质分别洗脱下来。 亲和色谱的洗脱 05 检测鉴定 6 1 0 2 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 6 1 0 2 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *