贯众中活性组分对金黄色葡萄球菌抑制作用的研究.docVIP

　　贯众中活性组分对金黄色葡萄球菌抑制作用的研究 作者：赵薇 程熠 李勇 李玉珍 张俏 范洪学 刘雅文 【摘要】 目的 分离贯众中活性组分，并研究其对老年肺部感染金黄色葡萄球菌的抑制作用。方法 采用pH3的95％乙醇进行回流提取，制成粗提液，并以石油醚、乙酸乙酯萃取，纸片法筛选活性部分，低压液相色谱做精分离，根据分离图谱的不同吸收峰位置来收集不同组分。采用三氯化铁+铁氰化钾多酚定性实验和Folin酚法进行组分的总多酚定量，以液体试管稀释法测定不同组分对老年肺部感染患者痰中分离的金黄色葡萄球菌的抑制作用。结果 贯众95％乙醇粗提液和乙酸乙酯萃取部分都具有较强的抑制作用，将后者经低压液相色谱分离后共获得13个组分，组分2、3、4、8、9、11、12和13均具有较强的抑菌及杀菌作用，其组分13的抑菌作用最强，其MIC为4.29 μg/ml，MBC为8.58 μg/ml。结论 贯众经乙醇粗提并且乙酸乙酯萃取部分中含有多种活性组分，具有较强的抑制及杀灭金黄色葡球菌作用。 【关键词】 贯众；金黄色葡萄球菌；分离；抑菌作用 金黄色葡萄球菌是老年肺部感染的常见菌，亦是院内感染的主要致病菌〔1〕，其感染率占G+菌首位，成为 治疗 的难点。贯众为鳞毛蕨科多年生草本植物粗茎鳞毛蕨（Dryopteris crassirhizoma Nakai）、蹄盖蕨科多年生草本植物娥眉蕨（Lunathyrium acrostichoides Ching）、乌毛蕨科多年生草本植物单芽狗脊（H肉汤等培养基（北京陆桥生物公司）；95％乙醇、石油醚、乙酸乙酯等为分析纯（北京化工厂生产）；Folin酚试剂等（北京鼎国生物公司）。 1.2 方法 1.2.1 贯众有效成份的提取 称取250 g的贯众干品，40目粉碎，以95％乙醇（pH3）1.5 L回流提取16 h，收集提取液旋转蒸发回收溶剂并浓缩，得到棕黑色黏稠的粗提物。依次以石油醚和乙酸乙酯萃取，并旋转蒸发回收溶剂并浓缩，形成石油醚萃取部分和乙酸乙酯萃取部分，同时收集每步的剩余水相。滤过除菌，-4℃保存。 1.2.2 乙酸乙酯萃取部分的液相色谱分离 将乙酸乙酯萃取部分用少量50%乙醇溶解，并用低压液相色谱分离系统进行分离制备（分离介质为PhamadexLH20），色谱柱柱围9.42 cm，洗脱液为50%乙醇（pH3）和70%乙醇（pH3）（1∶1）梯度洗脱，洗脱速度为24 ml/h，检测波长280 nm，将收集的液体按吸收峰图谱进行分离，同一个吸收峰的位置的洗脱液收集后并编号，记为一个组分。再以95%乙醇清洗介质并收集洗柱液，旋转蒸发回收乙醇并浓缩，滤过除菌，-20℃保存。 1.2.3 组分中多酚物质的定性分析 将样品组分1～13滴加在滤纸片上，干燥后滴加2%三氯化铁后观察，再依次滴加8％铁氰化钾和1 mol/L HCl，观察显色。 1.2.4 定组分中多酚组分的定量分析及重复性实验 采用Folin酚法〔6〕测定。以邻苯二酚0.027 5 μg/ml为标准品浓度，准确吸取100、200、300、400、500、600、700 μl于干燥试管中，然后用蒸馏水补足1 ml。另取1根干燥试管加1 ml蒸馏水作空白对照，分别加入3 ml FolinⅠ酚试剂，25℃水浴10 min，后加入50 μl FolinⅡ酚试剂，混匀，25℃水浴30 min，以空白调零，在500 nm处测定吸光度。分别测定30、60、90 min值并比较，绘制标准曲线并获得回归方程。准确吸取待测样品1、2、5、6、7、10、11各 300 μl及待测样品3、4、8、9、12、13各100 μl，测定吸光度，分别测定60、90 min的值并比较，根据回归方程 计算 组分中多酚组分的含量。准确吸取样品9、12、13各100 μl，测定吸光度，重复测定3次。 1.2.5 受试菌种的活化和菌悬液的制备 将受试菌种在营养琼脂斜面培养基上活化2～3代后，挑取菌落以无菌生理盐水稀释，浊度与0.5麦氏比浊管的浊度相近，以722分光光度计检测，含菌量为1.5×108 CFU/ml。 1.2.6 抑菌活性测定 制备直径为6 mm的灭菌滤纸片，分别放入粗提液、石油醚萃取部分及剩余水相、乙酸乙酯萃取部分及剩余水相中浸泡2 h，低温晾干，以溶剂混和物作为空白对照。取受试菌悬液0.5 ml均匀涂布于营养琼脂表面，待表面稍干，用无菌镊子取干燥药物及对照滤纸片贴在平板上，37℃，24 h后观察并测定抑菌圈直径。 1.2.7 活性组分的最小抑菌浓度（MIC）测定 采用液体试管法〔7〕。将液相色谱分离的各组分用无菌营养肉汤进行倍比稀释，其中组分1～8及对照1和对照2稀释4管，组分9～13稀释7管，每管1 ml中加入受试菌悬液0.1 ml。以酒精计测定样品