常用分子生物学技术概述-2009要点.ppt

操作对象： 核酸 蛋白质 主要内容 一、常用分子生物学技术： 质粒DNA的提取 基因组DNA/RNA的提取 核酸的纯化、分离及定量 聚合酶链式反应（PCR） DNA序列分析 核酸杂交技术 二、其他分子生物学技术： 主要技术 提取DNA总的原则 1 保证核酸一级结构的完整性； （pH 4～10；0 ～4℃;机械剪力；核酸酶等） 2 尽量排除其他分子的污染,保证提取核酸的纯度; 1)其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降低到最低程度； 2)核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的 有机溶剂和过高浓度的金属离子； 3)其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。 核酸分子抽提的技术路线的设计 1、核酸的释放： 破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法 （非机械法中溶胞法是应用最广泛的方法） 2、核酸的分离与纯化： 将含有核酸分子从复杂复合物或他物质分离中分离 3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等） 少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤 鉴定与保存 （一）核酸的鉴定 浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定 浓度与纯度鉴定 1 紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。 如计算DNA浓度： A260×稀释倍数×50＝ μg/ml 只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。 3 EB荧光分析法 荧光染料溴化乙锭(EB)，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于半定量分析。 完整性鉴定 凝胶电泳法： 基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象； 总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。 核酸的贮存——DNA保存 1、短期贮存： 4℃或-20℃存放于1×TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。 2、长期贮存： TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。 核酸的贮存——RNA保存 Rnase InhibitorRNA酶抑制剂Human Placental ribonuclease inhibitor（HPRI）是一种蛋白质，可与多种RNA酶（包括RNases A, B, C类）非共价结合成为等摩尔复合物，抑制RNA酶活性。 RNA可溶于DEPC水（焦碳酸二乙酯）中，在-70℃保存。 RNA可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可在-20℃保存。 质粒DNA的提取Plasmid DNA Preparation 质粒的基本概念 质粒提取的原理和方法 质粒的纯化 质粒DNA的提取 质粒：质粒是染色体以外能自身独立复制的超螺旋共价闭环双链DNA分子。 能自主复制，是能独立复制的复制子。 质粒能携带外源基因进入细菌中扩增或表达.是基因工程中广泛应用的基因运载工具. 常见质粒载体 pUC： pUC 119， pUC 118， pUC 18, pUC 19，T—载体 pBR：322，327 质粒DNA的提取和纯化 质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术． 1、细菌的培养 主要步骤： 2、细菌的收集与裂解 3、分离纯化 质粒提取的主要方法 质粒DNA的小量制备 2-5ml 质粒DNA的大量制备 500ml 碱裂解法 方法 煮沸法 SDS裂解法 Triton-溶菌酶法 质粒DNA提取方法的选择  ?? 常用的碱裂解法,煮沸法，SDS法均可获得较满意效果．至于有人采用碱裂解法提取小量细菌培养物的质粒， 用煮沸法或SDS法进行质粒DNA的大量分离， 只是各个实验室的习惯问题. 质粒提取的主要方法 碱裂解法： 质粒提取的主要方法 煮沸裂解法 质粒提取的主要方法 SDS裂解法 质粒DNA的纯化 基因组DNA/RNA的提取 Genomic DNA/RNA Preparation DNA提取 1、蛋白酶K－酚－氯仿法（酚抽提） 2、甲酰胺解聚法 3、试剂盒 酚抽提法 原理: 经消化或剪切匀浆成单个细胞的真核细胞,在蛋白酶K,SDS ,RN