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活性E玫瑰花结试验中实验条件的优化 　　 摘 要：本文就活性E玫瑰花结试验中如何优化实验材料、试剂、操作等实验条件，结合实际工作实践经验进行了阐述，同时对实验中的主要影响因素进行了探讨，以期提高实验的成功率。 　　关键词：E玫瑰花结试验SRBC淋巴细胞； 　　 　　E玫瑰花结试验是体外检测T淋巴细胞数量和免疫功能的一种经典方法，不同的反应条件可形成不同的花结。T淋巴细胞与较低比例的绵羊红细胞（SRBC）经37℃温育，低速离心后不经低温培养即可形成的花结称为活性E玫瑰花结（Ea-RFC），活性E玫瑰花结代表的是与SRBC具有高度亲和力的T细胞活性亚群[1]，能反应细胞水平，常与临床表现一致。活性E玫瑰花结试验虽然不需特殊设备，但影响因素多，重复性和稳定性不易控制，控制实验条件是试验成功的关键，因而笔者对Ea-RFC试验中的主要实验条件进行了归纳和优化，以期提高实验的成功率。 　　1 外周血单个核细胞的分离 　　1.1待检血样的采集采集血样传统的方法是使用一次性注射器抽取后注入试管，而真空采血管是取代注射器采血的换代产品，采集血样时可使用一次性采血针将血样采集于内置肝素钠抗凝剂或淋巴细胞分离液的真空采血管中，这样可以避免传统的使用注射器抽吸对血细胞造成的破坏作用，并且可以缩短血样的采集时间。采得之血样若需放置，应置4～8℃低温且不宜超过6h，并尽快分离淋巴细胞。 　　1.2 稀释液的选择对于肝素抗凝血，应先将抗凝血用等量稀释液稀释后再与分离液叠加。稀释液通常可使用含Ca2+、Mg2+的Hanks液、D-Hanks液、RPMI1640培养基、PBS缓冲液等。含Ca2+、Mg2+的Hanks液配方简单，具有与细胞生长状态下的一致的pH值、渗透压并且还可提供营养作用，是细胞培养基本用液，D-Hanks液多用于含胰酶的培养体系，RPMI1640培养基尤为适合贴壁细胞培养但价格较高，PBS缓冲液可作为Hanks液的替代液，因此Ea-RFC试验首选含Ca2+、Mg2+的Hanks液作为稀释液。由于Ea-RFC试验不经低温培养，配制含Ca2+、Mg2+的Hanks液亦可不加氯仿，以减少实验室毒害。 　　1.3 淋巴细胞的分离和悬液的配制 将已稀释血样与淋巴细胞分离液叠加前，稀释血样和分离液均应先置37℃预温，然后使用细径的滴管或毛细吸管吸取血样，叠加时应靠近管壁缓缓加入，这样可以避免血液冲破分离液界面，叠加后应立即水平离心，离心后吸取的单个核细胞必须用含Ca2+、Mg2+的Hanks液洗涤3次后方可使用。淋巴细胞悬液中小牛血清的浓度过低会造成细胞营养条件不足，浓度过高则会破坏缓冲体系，我们的经验表明小牛血清的最终浓度调整为20%时最为适宜，使用的小牛血清应先经56℃灭活30分钟。配制淋巴细胞悬液时若使用5.0g/L的水解乳蛋白代替Hanks液，可提高形成花结的稳定性。 　　2 SRBC悬液的制备 使用Alsever液，通常可以将SRBC保存3周而不影响受体活性，未采用Alsever液保存的SRBC在4～8℃条件下仅可保存2周。收集SRBC时应先将新鲜绵羊血以玻珠振摇脱纤维后再置于保存液中，洗涤SRBC时应使用Hanks液洗涤三次为宜，洗涤的次数不能随意增减，尤其要注意第三次洗涤时SRBC有无溶血现象，若有溶血现象，表示SRBC脆性增加已不适于应用，应当更换。 　　3 淋巴细胞和SRBC的混合比例活性E玫瑰花结试验中淋巴细胞和SRBC的混合比例与总E玫瑰花结(Et-RFC)试验相比要高，一般控制在1:10[2]。要想获得满意的花结形成效果，可用使用细胞计数仪或血细胞计数板检测后调整浓度。 　　4 离心条件的控制离心条件对于活性E玫瑰花结试验至关重要，T淋巴细胞与 SRBC之间的结合是比较松脆的，离心速度过高可使形成的花结分散，离心速度过低则两者的结合不够充分，因此实验时必须严格控制SRBC与淋巴细胞混合液的离心速度，务必保证不高于500r/min的低速离心，离心时尽量使用冷冻离心机，冷冻离心机由于在离心过程中可以精确调控转速，同时离心机内部的低温环境也可避免离心过程中离心管中样品升温，而活性E玫瑰花结试验的最适温度为4～24℃（在此范围内温度越低越好），因此冷冻离心机比普通离心机更适合Ea-RFC试验。 　　活性E玫瑰花结试验另外还会受绵羊的选择、所配制Hanks液的质量、血样标本的来源、实验季节（夏季结果偏低）以及操作手法等其他因素的影响，进行试验时操作程序一定要规范，耐心细致地控制和优化好各个实验步骤，这样才能得到满意的实验结果。 　　 　　参考文献： 　　[1] 宋愿志，韩彩霞，李培玲，等. E-玫瑰花形成试验实验因素的探讨[J]. 中国生化药物杂志,1993,3:68-71． 　　[2] 鲜尽红.免