线粒体基因突变.ppt

1992年荷兰Van den OuwelandmtRNA Leu(UUR)3243A→G Pax6（配对盒基因） Pax6最先从人类、小鼠、鱼、斑马中分离得到，其蛋白序列和功能在进化上高度保守，由于人类与小鼠间的同源性很高，Pax6突变小鼠或Pax6基因敲除小鼠已成为研究Pax6的重要工具 PCR—DGGE（变性梯度凝胶电泳） 原理： 是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。 变性 Tm 通过局部解链的DNA分子迁移率发生改变达到分离。 步骤： 1 PCR反应 2 产物经琼脂糖凝胶电泳确认 3 平行变性梯度凝胶电泳 4 垂直变性梯度凝胶电泳 Pax6 PD LNK PD PD HD LNK LNK HD HD PST 240aa 266aa 269aa 420aa 小鼠基因型鉴定（提取DNA，PCR测定） 为了区别野生型和杂合型小鼠,我们利用PCR和酶切鉴定的方法,建立了鉴定野生型、杂合型、纯合型小鼠的基因鉴定方法,该Pax6的突变位点恰巧形成了一个Hphl酶切位点,野生型小鼠PCR产物不能被Hphl切开,跑胶后出现一个530Pb的条带,而纯合型小鼠PCR产物带有突变位点,可被万肋彻开,从而产生两条带,一条大小是410Pb,另一条为120Pb.杂合子由于其一条染色体是野生型,另一条是突变型,故酶切后出现三条带,530Pb，410Pb，120Pb Western blot结果: Pax6蛋白结构由两个DNA结合PD结构域和HD同源域及一个富含PST的转录活化结构域组成,由于该突变的发生引起Pax6蛋白的HD结构域(homocdomani)的最后5个氨基酸和PST结构域缺失,则突变的染色体不能被翻译成蛋白质,引起纯合Pax6的突变完全不能产生Pax6蛋白产物,杂合Pax6的突变只有一条染色体被翻译成蛋白,则蛋白表达量减少(图ID)。Western blot以β-action为内参照,结果显示Pax6突变杂合型小鼠组织中的Pax6蛋白表达量明显减少。 PAX6在体内蛋白表达的鉴定 （蛋白质免疫印记杂交 western blot） 1.小鼠基础代谢指标检测 注：空心表示野生型，黑色实心代表突变型 随年龄增长Pax6突变小鼠与野生小鼠体重变化曲线。 体脂含量比较 食后空腹状态和正常进食状态血糖水平比较 ?细胞 胰升糖素(glucagon) ?细胞 胰岛素(insulin) ?细胞 生长抑素(somatostatin) 胰岛的结构与功能 2.胰岛形态学观察 Wt代表对照组 Mu加Lnt代表实验组 A、B：24周龄 C、D：16周龄 红染的是β细胞 蓝染的是α细胞 实验组小鼠胰岛内部出现明显的结构改变 3.葡萄糖耐受实验(GTT) Pax6突变小鼠较正常小鼠对葡萄糖的清除能力下降 4.胰岛素耐受实验(ITT) * 口服葡萄糖耐量（OGTT）试验 正常人体血糖水平维持动态平衡，即使食入大量葡萄糖，体内血糖水平也不会出现大的波动和持续升高，这种人体对摄入的葡萄糖具有很高的耐受能力的现象称为耐糖现象。 对葡萄糖的耐受能力称为葡萄糖耐量 (glucose tolerence)，它反映机体调节糖代谢的能力。 口服葡萄糖耐量（OGTT）试验 正常人体血糖水平维持动态平衡，即使食入大量葡萄糖，体内血糖水平也不会出现大的波动和持续升高，这种人体对摄入的葡萄糖具有很高的耐受能力的现象称为耐糖现象。 对葡萄糖的耐受能力称为葡萄糖耐量 (glucose tolerence)，它反映机体调节糖代谢的能力。 Pax6含两个DNA结合域，分别为含127个氨基酸的成对域PD和含60个氨基酸的同源域HD，两个结构域之间通过一个富含Glu／Gly(Glu／Gly—rich)的79个氨基酸的片段相连接。PD结构域是Pax蛋白家族成员的标志，为双向DNA结合域，包括两个螺旋一转角一螺旋(helix—turn—helix，HTH)基序，即PAI(N端)和RED(C端)亚基。与HD羧基端相连的是一个富含脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸(Pro／Ser／Thr—rich)的转录激活结构域，即PST。在细胞中PST结构域可激活Pax6蛋白调控的下游基因，如胰岛素和高血糖素基因启动子的转录。 已证实pax6在所有类型的胰岛细胞（α，β，δ，γ细胞）内均有表达。Pax6突变小鼠随着年龄的增长，胰腺4种细胞的数量逐渐减少，随之胰岛的正常结构也被破坏，出现糖耐量异常乃至糖尿病。Pax4为哺乳动物分泌胰岛素的β细胞分化和成熟所必需，而pax6同时参与胰腺分泌胰高血糖素的α细胞分化、成熟以及β细胞的分化及胰岛素的表达。研究发现人类pax6-r240stop突变可导致胰岛素激素原转化酶（pr