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PCR基础理论 一、半保留复制及转录、逆转录 (1)DNA的半保留复制(semiconservative replication) DNA是所有原核生物和真核生物遗传的主要物质基础。在这些生物中遗传信息以遗传密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序,并通过DNA复制(replication)由亲代传给子代。在DNA合成进行时，以两条亲代DNA链中的每一条链为模板，在DNA指导下的DNA聚合酶催化下，按A与T、G与C碱基配对原则合成子代DNA的过程称DNA的复制。由于复制合成的子代DNA两条脱氧核糖核苷酸链中有一条来自亲代DNA，另一条是以前者为模板新合成的子代DNA链，所以DNA的这种合成作用又称半保留复制(图1)。 (2)RNA的转录（transcription）以DNA为模板合成RNA的过程称为转录（transcription）。转录是生物界RNA合成的主要方式，是遗传信息DNA向RNA传递过程，也是基因表达的开始。转录也是一种酶促的核苷酸聚合过程，所需的酶叫做依赖DNA的RNA聚合酶（DNA-dependent RNA polynerase ,DDRP）。转录产生初级转录物为RNA前体（RNA precursor），它们必须经过加工过程变为成熟的RNA，才能表现其生物活性。RNA的转录合成从化学角度来讲类似于DNA的复制，多核苷酸链的合成都是以5’→3’的方向，在3’-OH末端与加入的核苷酸磷酸二酯键，但是，由于复制和转录的目的不同，转录又具有其特点：（1）对于一个基因组来说，转录只发生在一部分基因，而且每个基因的转录都受到相对独立的控制；（2）转录是不对称的。（3）转录时不需要引物，而且RNA链的合成是连续的。转录的主要过程分为识别与起始、延长和终止三个阶段。（transcription）以RNA为板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序(其中与A配对)合成DNA。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反，故称为转录，催化此过程的DNA聚合酶叫做转录酶(reverse transcriptase)。大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性。反转录酶的发现对于工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。 ”,这种新链又可成为下次循环的模板，每完成一个循环需2－4分钟，2－3个小时就能将待扩目标基因扩增放大几百万倍。 PCR反应五要素参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+④ 循环次数：循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 PCR反应特点 特异性强：PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 简便、快速：PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 三、PCR仪： 随着分子生物学的创立与发展，PCR测定方法作为一门崭新的技术已经在遗传疾病的诊断、临床标本中病原体核酸的检测、激活癌基因中突变情况的分析、法医学上的遗传学鉴定以及分子克隆诸方面得以越来越广泛的应用。实现这项技术的工具――PCR扩增