结肠癌患者转录因子Snail mRNA和蛋白的表达及临床意义.docVIP

　　结肠癌患者转录因子Snail mRNA和蛋白的表达及临床意义 作者：陆洪军 王淑秋 刘振平 任翊华 【摘要】 　　目的 探讨转录因子Snail mRNA和蛋白在结肠癌中的表达及临床意义。方法 分别采用RTPCR和T) 是包括结肠癌在内的许多肿瘤细胞获得侵袭、转移能力的重要机制。转录因子Snail通过与Ecadherin启动子区的E盒(Ebox)结合，下调Ecadherin的表达，进而诱导EMT的发生，促使肿瘤细胞侵袭转移〔1〕。本文旨在探讨转录因子Snail在结肠癌中的表达，以判定该转录因子在结肠癌侵袭、转移中的作用。 　　1 对象与方法 　　1.1 对象 　　2007年1月至2008年8月，在本院行根治性手术的大肠癌患者68例，男42例，女26例；年龄32～75岁(中位年龄57.3岁)；术中留取标本。所有病例术前均未接受化疗及放疗。①肿瘤部位：左半结肠38例、右半结肠30例；②肿瘤大小：≤5 cm者48例、＞5 cm者20例。③组织学分型：乳头状腺癌4例，管状腺癌48例，黏液腺癌11例，印戒细胞癌5例；④分化程度：高分化腺癌24例，中分化腺癌30例，低分化腺癌14例；⑤浸润深度：未及浆膜层25例，浸及浆膜层43例；⑥淋巴结转移：有转移18例，无转移50例；⑦Dukes分期：A期32例，B期20例，C期11例，D期5例。另取20例结肠癌正常肠段的肠黏膜(经病理检查无异常)作对照。 所用试剂为兔抗人Snail多克隆抗体(购自Santa Cruz公司)；逆转录酶试剂盒(购自Promega公司)；Trizol试剂(购自美国宝生公司)。 　　1.2 方法 　　1.2.1 Snail mRNA检测 　　按Trizol试剂盒说明提取总RNA。用紫外分光光度仪测定A260/A280，比值在1.9～2.0之间， 计算 RNA含量。引物设计：(1)上游引物：5′AATCGGAAGCCTAACTACAG3′；下游引物：5′GGAACAGGCTGAAGTAGAG3′(扩增长度320 bp)。(2)GAPDH：上游引物：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′；下游引物：5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′ (扩增长度452 bp，为内参照)。逆转录反应按试剂盒操作。RTPCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离检测。 　　1.2.2 Snail 蛋白的检测 　　 　　SF、2 μg/ml Aprotinin、0.5 μg/ml Leupeptin)，超声破碎，4℃ 12 000 r/min离心5 min，收集上清液。细胞核蛋白提取：参照 　 　2 结 果 　　2.1 结肠癌组织Snail mRNA表达与临床病理因素的关系 　　Snail mRNA在结肠癌中的表达水平与性别、年龄、肿瘤部位及大小无关(P＞0.05)，而与肿瘤浸润深度、组织学分型、分化程度、淋巴结转移及Dukes分期均有关。Snail mRNA在黏液癌(印戒细胞癌、黏液腺癌)、低分化、浸及浆膜、有淋巴结转移及处于Dukes C+D期的结肠癌组织中表达均明显增高(P＜0.05，P＜0.001)。Snail与结肠癌肿瘤细胞的侵袭、转移密切相关。见表1。表1 结肠癌组织Snail mRNA表达指数与临床病理因素间的关系(略) 　　2.2 结肠癌和癌旁组织Snail mRNA及其蛋白的表达 　　结肠癌组织与癌旁正常肠黏膜组织中均有Snail mRNA表达，但与正常结肠上皮相比较，结肠癌Snail mRNA的表达升高(P＜0.01)。见表2和图1。结肠癌Snail P30条带较正常对照组加宽加深，应用Chen Image 5500v2.03软件 计算 蛋白平均灰度值，结果显示Snail蛋白表达与正常结肠上皮相比较，有显著差异(P＜0.001)。见表2和图2。表2 结肠癌和癌旁正常肠黏膜组织中Snail mRNA及其蛋白的表达(略) 　 　3 讨 论 EMT是指上皮细胞在特定的生理和病理条件下向间充质细胞转化的现象，是许多肿瘤细胞获得侵袭、转移能力的重要机制〔4〕。EMT在个体胚胎发育、组织形成、伤口愈合和慢性炎症中，均发挥着重要作用〔5〕。研究证实，Snail参与了包括乳腺癌、胃癌和鳞状上皮细胞癌在内的某些肿瘤细胞发生EMT并促进其侵袭转移〔6～8〕。Snail可使细胞E钙黏素及α、β、γ连环素等上皮细胞标志物表达降低或消失，可表达成纤维细胞特异性蛋白1、N连环素等多种间充质细胞标志蛋白，且可增强肿瘤细胞侵袭和转移能力。在一定条件下逆转EMT表型时，就可以降低肿瘤细胞的侵袭转移能力并延长荷瘤动物的生存期。 Snail通过以下机制引起肿瘤侵袭转移：① 作用于启动子上的Eboxes连接基序，直接抑制Ecadheri