高表达ΔNp73基因对大肠癌细胞生物学行为的影响及其机制研究的论文.docVIP

　　高表达ΔNp73基因对大肠癌细胞生物学行为的影响及其机制研究的论文 【摘要】 目的 通过增强肿瘤细胞中外源性δnp73基因的表达, 探讨该基因对大肠癌细胞生物学行为的影响。方法 以人类大肠癌细胞株lovo细胞为研究对象，将δnp73基因用脂质体法转染lovo细胞，进行细胞生长曲线和流式细胞术分析，测定转染δnp73基因后的lovo细胞的增殖能力与凋亡率；以boyden 小室体外侵袭实验检测δnp73基因转染前后lovo细胞侵袭力变化，并用i1640培养基、小牛血清购自hycolone公司。胰蛋白酶购自sigma公司。millicell chamber购自millipore公司。四甲基偶氮唑蓝(mtt)、青霉素、链霉素均购自gibco试剂公司。vegf试剂盒购自rd公司。 1.2 lovoδnp73细胞株的建立 以人类大肠癌细胞株lovo细胞为研究对象，将构建于真核表达质粒pcdna3δnp73基因用脂质体法转染lovo细胞，用g418沉筛选出过表达δnp73基因的细胞株，命名为lovoδnp73细胞株；同时以空载体pcdna3转染细胞，命名为lovopcdna3。 1.3 台盼兰活细胞记数测定细胞的增殖能力与细胞活力 胰酶消化收获细胞（含悬浮及贴壁细胞）制备单细胞悬液，以冷pbs悬浮，细胞浓度为1×105/ml。取9滴细胞悬液移入小试管内，加1滴0.4%台盼兰工作液，混匀，在3min内用血球记数板分别记数活细胞和死细胞。 1.4 细胞增殖曲线mtt测定 取对数生长期细胞悬液200μl/孔（含2×103个细胞）接种至96孔板，于37℃、5% co2、饱和湿度培养箱，每组每天取3个复孔，每孔加入20μlmtt（5g/l）培养4h后弃培养液，每孔加入二甲基亚砜(dmso)200μl，振荡10min溶解结晶紫。酶联免疫检测仪测定490nm波长各孔光吸收值（a490值）。 1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 将lovo细胞制备成单细胞悬液，收集到5ml离心管中，离心，2 000g，5min，室温，冷pbs洗涤2次，离心，2 000g，5min，弃上清。再以冷pbs悬浮，细胞浓度为1×106ml。加5ml annexin vfitc溶液和2.5μl pi到100μl细胞悬液中，混匀后室温避光反应30min。加入反应缓冲液400μl，流式细胞术对凋亡细胞进行定量检测。 1.6 boyden小室体外侵袭实验 用改良的boyden小室法[1]：用人工基质覆盖millicell chamber滤膜上的微孔，向小室内加入1×105/ml的细胞悬液, 培养 12h 后取出滤膜, 将下室面的细胞刮下，将膜固定，结晶紫染色细胞，高倍镜下随机取5个视野,计数细胞,取平均值。 1.7 in×4,加入兔抗人vegf单克隆抗体(1∶350),37℃孵育1h,pbs洗膜5min×4,再加入羊抗兔igg(1∶2 000),37℃孵育1h,pbs洗膜5min×4,化学发光试剂与pvdf膜共同孵育1min,将pvdf膜与x光片共同放暗盒曝光4min,显影3min,定影10min。以gelproanalyzer凝胶定量分析软件分析tt法测定细胞生长曲线 mtt结果显示，转染δnp73的lovo细胞较转染空载体pcdna3的lovo细胞组和空白对照组细胞生长明显增快，差异有统计学意义（plt;0.01），见图1。 图1 mtt法测定细胞生长曲线 2.3 基因转染对大肠癌细胞凋亡率的影响 fitcpi流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示转染空载体pcdna3的lovo细胞组凋亡率为（5.8＋1.2）％，而转染δnp73的lovo细胞组的凋亡率为（2.4＋0.8）％，与lovo/pcdna3组对比凋亡率明显降低（plt;0.01），见图2。 图2 δnp73转染对lovo细胞凋亡的影响 2.4 boyden 小室体外侵袭实验 lovo、lovopcdna3 和 lovoδnp73细胞穿过人工基底膜的细胞数分别为（21.4±0.1）、（22.8±0.4） 和（39.5±0.6）, lovoδnp73 细胞与lovo 细胞和 lovopcdna3细胞比较, 穿膜数量明显增加, 两者间差异具有统计学意义(plt;0.01) 。而lovo细胞和 lovopcdna3细胞穿膜数的差异无统计学意义(pgt;0.05) 。 2.5 vegf蛋白表达tt测定对转染后细胞的体外生长情况进行了分析。台盼兰拒染、mtt测定均可反映细胞的增殖情况，但作用的机制与侧重点不同。台盼兰是一种有机染料，当细胞损伤或死亡时，可透过细胞膜与解体的dna结合，使其着色，而活细胞阻止其进入，借此可鉴别活细胞和死细胞。本实验用该方法测定细胞的总数与存活率。mtt