化学小分子探针在药物发现中的应用汇.docVIP

化学小分子探针在药物发现中的应用 仇文卫，汤杰 华东师范大学化学系、药物化学研究所 当今创新药物的发现越来越依赖于靶点的发现以及靶点与活性化合物作用模式的确定，化学小分子探针在这两方面的特出优越性使其成为药物化学的研究热点。 创新药物的发现、靶点与化学小分子探针 药物可以挽救生命、治疗疾病、改善健康状况、缓解痛苦和各种不适，因此，可以说药物改变着我们的生活，也影响着整个世界。然而，目前开发新药的费用平均每个高达数亿美元，尽管投入如此之高，从研发到上市仍约需10-12年之久（图1）。因此新药研发迫切需要新技术、新理论，以提高效率、缩短周期。 图1. 新药研发过程 现代药物的发现过程主要包括靶点(target)的识别、先导物的发现、结构优化、临床前及临床试验 图3 ABPP及PAL-ABPP探针分子标记靶点蛋白 photoaffinity labeling group, PAL)，其作用类似于反应基团。在探针分子与靶点蛋白形成复合物后经紫外光照射，光亲和标记基团分解产生很活泼的反应中间体卡宾，将探针分子标记(共价修饰)在靶点蛋白的活性部位，这种探针分子可称为PAL-ABPP探针分子，也包括四个功能部位：结合基团、光亲和标记基团、链接部位、报告基团(图3 B)。 2.2 结合基团 结合基团(BG)是探针分子最重要的部分，理想情况下它必须将探针分子特异性的导向处于功能状态下的靶点蛋白的活性位点，使探针分子与靶点作用，而不与环境中的其他生物分子作用。 2.3 反应基团 图4. 各种光亲和标记基团的标记反应 三者之中，三氟甲基苯基双吖丙啶是最接近理想的光亲和基团。 2.6 连接部位 连接部位是连接结合基团、反应基团与报告基团的一段柔性的链状结构，它有以下两个方面的作用：在活性基团与报告基团间制造足够的空间，以避免探针分子立体结构的拥挤而保持分子活性及提高标记的效率；链接基团可以是一段直链烷烃链或多聚乙二醇链，前者有利于提高探针分子的疏水性而有利于其透过细胞膜，后者对于疏水性的探针分子来说可以增强其水溶性。 2.7 报告基团 报告基团(Tag)的作用是方便人们简单快速的识别或纯化被标记的蛋白。最常用的报告基团有荧光基团(fluorescence group)及生物素(Biotin)等。荧光素如Rhodamine、FAM、FITC、BODIPY、Cy3、Cy5等具有灵敏性高的特点，同时可以利用现代质谱技术定量检测标记蛋白。生物素(biotin)由于其与Avidin蛋白有很强的特异性结合能力(1015M-1)，因此可以富集、纯化或识别被标记蛋白，Biotin与Avidin的复合物通常可使用盐酸胍溶液(guanidine-HCl)、SDS溶液、Biotin溶液等使其解析。 图5 生物素(biotin)富集、纯化、识别被标记的蛋白及肽片段 “点击化学”（Click Chemistry）在化学小分子探针合成中的应用 Click chemistry(简称CC)，又称点击化学，是最近几年发展起来的一种化学合成新技术，click是点击鼠标的声音，意思是这个反应非常容易而且可靠，就像点击鼠标一样。2001年，美国Scripps研究所诺贝尔奖获得者Sharpless等提出CC这一概念，是指具有以下特征的化学反应：反应原料易得，反应非常可靠，对氧气、水不敏感，产物立体选择性好、产率高，反应后处理及产物分离简单方便，一般不需要柱层析，反应副产物对环境友好。其中最重要的“click”反应是指炔基在Cu(I)催化下与叠氮基形成稳定的1, 2, 3-三氮唑化合物(也称Huisgen 1, 3-偶极环加成)的反应，在组合化学、靶点导向的活性小分子合成及生物偶联技术等方面有着较好的应用。CC技术的出现也极大地促进了化学小分子探针技术的发展。 直到最近ABPP探针分子标记实验一直是在细胞或组织匀浆液中进行的(这些体外的蛋白组样品只能大致的反应蛋白质在活细胞或组织中的功能状态)，一个主要的原因是报告基团体积很大使得小分子探针的分子量通常在700～1000Da，限制了探针分子的吸收、分布，甚至可能改变探针分子的作用模式。美国Scripps研究所Cravatt等最早将CC与ABPP技术结合起来，发展了CC-ABPP策略：靶点蛋白首先被探针分子标记 (PS-N3)，然后在Cu(I)催化下与标签分子发生环加成反应生成三氮唑分子将标签连接到探针分子上(图6)，克服了ABPP探针分子的上述缺点。CC-ABPP探针分子设计包括结合基团、反应基团、连接部位、潜在的报告基团(一般为体积很小的叠氮基，在探针分子标记了靶标蛋白后，可与带有炔基的报告基团发生“click”反应将报告基团引入探针分子；或也可为炔基，可与带有叠氮基的报告基团发生“click”反应将报告基团引入探针分子)。