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ELISA基础知识和注意事项 类容 ELISA的基本原理和相关概念 特别说说捕获法 ELISA结果的影响因素 ELISA结果的处理 ELISA的基本原理和相关概念 将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或 抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保留与相应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保留酶的活性。 由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗体反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感性。 ELISA的基本原理 抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表面后，仍然能保持其免疫学活性而能相互特异性结合。 抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下显色，颜色的深浅与特异性抗体水平成比例关系，可进行定性和定量分析。 ELISA的分类 测抗原：竞争法（也可用于测抗体）、双抗体夹心法。 测抗体：间接法、捕获法、双抗原夹心法 竞争法elisa 竞争法ELISA原理——标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，标本中的抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗原越少，显色越浅。 要用于小分子抗原或半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。 双抗体夹心法 双抗体夹心法ELISA ——将特异性抗体包被于固相载体表面，与标本中相应抗原相结合，洗涤后再加入酶标的第二特异性抗体与抗原结合，加入底物后显色。 检测测抗原要有至少具有2个抗原决定簇 双抗原夹心法 双抗原夹心法ELISA——检测标本中的总抗体（包括IgM和IgG型抗体） 。将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中特异性IgM和IgG型抗体结合，洗涤后加入酶标的特异性抗原与相应的抗体结合，洗涤后加入底物显色 间接法 间接法 ELISA（Indirect ELISA）——将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中相应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗人IgG或IgM抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。 酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子 只需要变换包被抗原，就可用一种酶标二抗检测各种与抗原结合的抗体 捕获法 ELISA（Capture ELISA）——专门用来检测IgM型抗体的方法。将抗人IgM抗体包被于固相载体表面，与标本中所有人IgM抗体结合，洗涤后加入特异性抗原与相应的特异性IgM抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。 区别理解 检测抗原？抗体？ 包被什么？ 标记什么？ 间接法和捕获法比较 间接法：假阴性，假阳性 捕获法：酶标抗体的要求较高 间接法的假阳性 间接法的假阴性 ELISA的有关名词概念 质控血清：质控血清是为了对实验结果进行控制而配制的血清。质控血清可以是定值也可以是不定值，可以购置也可以自配。自己配制时要注意选用无脂血的血清或血浆，不能用试剂盒内的阳性对照。若用稀释的血清作为质控血清，应考虑稀释基质成分对结果的影响。因质控血清与临床标本不一致，应该注意对结果的分析，应该注意质控血清只能用于质控活动，不可用于标定仪器或评价方法。用于室内质控的质控血清一般选取CUTOFF值2-3倍的质控品。 室内质控：实验室内部使用控制实验结果可靠性的一种质量控制。 室间质评：用于考核各个实验室结果可靠性的一种考核，可分为国家级和地方级的室间质评。可以理解为 “各个实验室的质量评比”。 临界值（CUTOFF值）：临界值是判断阴阳性或有临床意义水平的数值，临界值的确定是测定大量数据后应用统计学方法确定的。许多试剂都会给出临界值或临界值的计算方法。 本底：就是底色。如ELISA HBsAg，阳性显色，阴性不显色，本底就是整个阴性显色的情况。ELISA 抗–HBcAb，阳性不显色，阴性显色，本底就是整个阳性显色的情况。 灵敏度：能检测到的分析物的最小量，表示检测下限的能力。 相对灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100% 测定方法及表示方法：灵敏度标准品、质控血清、阳性标本稀释终点、血清盘（pannel）及临床标本阳性率。 特异性： 真阴性标本的检出能力。 相对特异性=真阴性/（真阴性+假阳性）×100% 测定及表示方法：质控血清、血清盘、临床标本阴性率。 Elisa结果的影响因素 试剂盒的选择 标本 加样与稀释 温育 洗版 显色 质控 试剂盒的选择 同行的试剂使用情况 上级部门对试剂实际使用的综合评价 使用临界值质控血清进行实际检测比较,选择林敏度和准确度高、特异性强试剂盒 标本 应注意避免溶血 在5 天内测定的血清标本可放置于4℃、超过一周测定的需－20℃保存 尽量避免反复冻融（少量分装） 加样和稀释 加样本的准确性（个人因素和实验条件） 尽可能排除主关因素（尽可能用加样枪，避免直接使用滴瓶） 各种试剂盒标本的稀释使用，严格按照说明是操作 温育