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2003-09-14 系列实用HPLC问答 山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司 2003.09.20 目录 1什么级别的水可以满足HPLC分析的要求，如何得到色谱用水？ 2 HPLC应该准备哪些常规的流动相试剂？ 3 可否用分析纯的溶剂代替色谱级的溶剂来作为液相色谱的流动相？ 4 HPLC的流动相常见的脱气方法有哪些？如何避免气泡产生？ 5 液相色谱的流动相可以放置多长时间？ 6 在HPLC流动相中，乙醇代替甲醇可以吗？ 7 请教关于流动相中加入离子对试剂的问题 8 流动相多长时间才能平衡？ 9 纯水到底能不能冲洗色谱柱？ 10 如何过滤流动相？ 11 问HPLC流动相能否直接循环使用？ 12 正、反相系统互换时，应注意什么，有何要求？ 13 怎样清洗进样针？ 14 如何确定被测组分HPLC的检测波长？ 15 面积归一化法有多大的可靠性? 16 请问L1和L8是什么类型的柱子?它是怎么规定的？ 17 液相色谱必须要配柱温箱吗？ 18 HPLC测定中定量误差的可能来源？ 1 什么级别的水可以满足HPLC分析的要求，如何得到色谱用水？ 理论上应使用超纯水，但在实际操作中，应根据不同的仪器要求、具体的实际情况灵活掌握。 理想的HPLC用水应为18.2mΩ/cm的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及CO2等。 MS检测器的要求最高。从实际使用的效果看，市售优质纯水或蒸馏水，如果水质新鲜，再过滤完全可以满足四极杆HPLC-MS检测的基本要求，但易受瓶子中塑料添加剂的污染。而对于研究级的飞行时间质谱的HPLC-MS，只有新鲜的超纯水才能满足分析的要求。 近些年来逐步普及的ELSD检测器，由于其特点，水中的颗粒将直接影响仪器的灵敏度和噪音，最好使用超纯水。 对于UV和DAD检测器，经过二次处理的各种水再过滤和脱气基本可以满足分析要求。如果水质好，不过滤和脱气一般问题也不大，有时去离子水也可勉强使用。从波长来看，低波长分析用水高于高波长分析的用水，梯度分析用水高于等度分析用水，尤其在紫外较底波长时，最好使用超纯水，否则极易出干扰峰，影响整个色谱图的质量。 示差和荧光检测器由于其灵敏度和专业性，其用水比紫外要求还可以低一些。 除了从仪器的性能特点考虑外，不同使用部门，对水的要求也不尽相同，如质量监督部门应使用专门的仪器用水，有严格的质量保证，具有可溯源性。 HPLC用水可以通过以下几个方面来得到： 1 专门的纯水机或超纯水机。按用途，超纯水可以分为二个大类，仪器专用和生物培养专用，仪器用的超纯水高配置的除了交换柱外，还有紫外灯和0.22um过滤头二个可配附件。由于其交换柱、过滤头、紫外灯是一次性消耗，成本，但质量保证，使用方便。 2 去离子水重蒸，将去离子水经石英蒸溜或亚沸后使用，注意不能将所有水都蒸出来，蒸出3／4为宜，剩下的因离子和杂质含量高弃去，否则重蒸将行同虚设。 3 二次或三次重蒸水，具体方法同上差不多，由于不同地区自来水初始的水质差别很大，出水率自己判断，同时要经常清洗，质量比较难控制。 4 采用类似家用的纯水机，其采用反渗膜系统，出水率约70％，离子除去率在95％以上，水质略低于去离子水，后面加一个阴阳交换树脂，出水可达到15mΩ/cm，过滤后水质不低于市售的纯水或蒸馏水，使用方便。 5 市场上桶装的纯净水或蒸馏水，水在1－10mΩ/cm之间，选择质优的产品基本可以满足HPLC分析要求，也不一定要过滤。 6 其它途径，有些生产单位自己有类似级别的水如注射用水、电子厂的清洗水、锅炉蒸馏水等，过滤后可以直接使用。 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。 2 HPLC应该准备哪些常规的流动相试剂？ 第一是HPLC级的水，具体要求可见上。 第二是有机溶剂，反相最常用的是甲醇和乙腈，其次是四氢呋喃、异丙醇、醋酸。正相试剂种类较多，较常用的是正已烷、正庚烷、正戊烷、、二氯甲烷、其它的如环已烷、环戊烷、氯仿、丙酮、二氧六圜、四氢呋喃、乙醇、乙醚等。 第三是流动相改性剂： 酸性试剂有醋酸、甲酸、硫酸、磷酸、三氟醋酸、高氯酸。盐酸中氯离子对不锈钢管路有腐蚀作用，极少加到流动相中，硝酸有氧化性，可用于管路的清洗，也不建议单独添加到流动相中。 碱性试剂有氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙胺、二乙胺等。 无机（有机）盐种类很多，往往组成缓冲系统，比较常用的有醋酸钠、醋酸铵、甲酸钠、磷酸二氢钾（钠、铵）、磷酸氢二钾（钠、铵）、硫酸钾（钠）、其它的如酒石酸钾钠、柠檬酸钠、草酸钠、EDTA、碳酸铵等。 第四是专用的离子对试剂： 酸性化合物的离子对试剂最常见的是四丁基氢氧化胺（TBA），其它的如四丁基氯化胺、四丁基溴化胺。 碱性化合物的离子对试剂最常见的是庚烷磺酸钠、己烷磺酸钠、十二烷基磺酸钠等。 HPLC的流动