3-薄层色谱要点.ppt

* 三、常用色谱指纹谱实验技术 ◆ 薄层色谱(TLC) ◆ 高效液相色谱(HPLC) ◆ 气相色谱(GC) ◆ 毛细管电泳(CE) （一）薄层色谱 1.概 述 快速、简单、灵敏——鉴别、含量分析 器械、仪器、计算机化、自动化——快速发展 指纹谱特点： ①结果直观 ②离线操作的灵活性 2.薄层色谱操作规程 可选择 可选择 系统适用性试验 检测限 比移值(Rf) 分离度 自动多次展开 全自动定量点样 薄层指纹图谱报告 ◆简单操 作组合 供试品溶液制备 手工半定量点样 玻璃双槽展开箱展开 显色 直观观测(可见光及紫外光)判断样品指纹谱相似度 拍摄色谱图像照片记录 ◆复杂操作组合 供试品溶液制备 计算机控制半自动或全自动定量点样 玻璃双槽展开箱展开或自动展开箱展开 显色 直观观测(可见光及紫外光) 拍摄色谱图像照片记录 数码成像及数据处理 薄层扫描-积分数据 计算机相似度评价 3.薄层色谱的规范化 (1)器材的规范化 固液萃取小柱；定量微升毛细管；标准展开箱或双槽展开箱；预制薄层板；展开条件控制槽；紫外光灯；显色喷雾器或浸渍显色用玻璃缸；薄层色谱扫描仪。 半自动薄层点样器；计算机控制、参数可与薄层扫描仪共享的全自动薄层点样器；自动展开箱；薄层色谱成像及图像处理系统。 (2)操作规程的规范化 点样——展开——显色 (3)供试品溶液的预处理 “杂质”——对待测的活性成分或指标成分形成干扰。不经预处理，很难得到清晰明确的结果。例 方法：A.加热回流 B.超声提取 C.液液萃取 D.固液萃取——样品的提取液通过固相小柱处理。吸附、键合相分配、正相、反相、离子对、离子交换原理富集待测组分，去除部分杂质。 如雪莲花, 甲醇提取液，不经净化处理，色谱的可见光或荧光图像与经预处理(Ｃ18小柱洗脱)的图像比较，很显然经过预处理将杂质去除后色谱图像质量明显提高。 (4)展开溶剂的选择 展开剂———薄层色谱的关键 展开剂优化———依靠经验 展开剂要求———分离度高，斑点多。 展开剂最优化模式难以计算： （1）样品中多类别成分共存，优化模式难以外延。 （2）溶剂蒸气在展开中起着举足轻重作用，但又难以获得可测量的参数。 鉴别判断信息多 (5)溶剂蒸气对色谱行为的影响 薄层色谱——“开放”环境下展开，展开剂蒸气也参与展开全过程。 展开前蒸气预平衡 调整蒸气浓度 保持展开溶剂新鲜度 改善色谱质量 黄 连 溶剂系统：苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-28％氨水(6：3：1.5：1.5：0.25，S1)。 检测：置紫外光灯(365nm)下检视 图 黄连的荧光薄层色谱图 1.巴马汀；2.小檗碱；3.表小檗碱；4.黄连碱；5、6.味连；7、8.雅连；9、10.云连；11、12.商品黄连；13.药根碱；14.非洲防己碱 S1中浓氨液的蒸气相在色谱中起了关键作用： A 仅用S1预平衡15min，氨蒸气量不足，药根碱、非洲防己碱、巴马汀、小檗碱均不能分开； B 改用浓氨水5ml在一侧槽中预平衡15min后展开，则药根碱+非洲防己碱、巴马汀、小檗碱均得到分离； C S1中除去浓氨水，仅用浓氨水预平衡，色谱分离度仍很差； D S1中浓氨水改为水，一侧槽中用浓氨水平衡，分离效果同B。 巴马汀 小檗碱 表小檗碱 黄连碱 大 黄 游离蒽醌薄层色谱分析, 展开剂为石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)，用新鲜开瓶的甲酸乙酯时，5种游离蒽醌分离度很好。若用反复多次开瓶使用的甲酸乙酯时，由于甲酸乙酯吸收了空气中水分而或多或少分解而导致色谱的分离度大大降低。 或配好的展开剂 反复多次使用， 各溶剂比例改变， 色谱重现性差。 1.芦荟大黄素 2.大黄酸 3.大黄素 4.大黄素甲醚 5.大黄酚 (6)环境因素的影响 相对湿度——分离度 （牛胆汁：RH30％,牛磺、甘 氨及其去氧胆酸分开；RH72％，四种分不开） 温 度——分离度和Rf值 三七药材中的三七皂苷R１与人参皂苷Re只有在低温(10℃)才能分开。 R１ + Re R１ Re Re R１ 实例——人参类药材薄层色谱指纹图谱 1.试验材料及仪器 (1) 对照品 人参皂苷Ro、Rbl、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg