9 未培养微生物要点.ppt

策略4：能量限制 研究发现，甲烷局部压力增加到101MPa（约15mM可溶甲烷）会明显地使AOM体外反应速率提高5倍。 高分压甲烷的海水培养基中培养沉积物的装置：通过水压泵（HP）的压力使注射器（S）中的培养基通过活塞（P）注射入培养瓶（T）来缓慢增加钢瓶（SC）中的外周水（W）的压力，T顶空中气体为甲烷。这种设计可使气相完全溶解，并防止培养瓶爆炸，因为内部压力Pi=外界压力Pe。 策略5：偶联 从甲烷利用到硫酸盐还原，之间电子的传递可通过一种或一类有机化合物、电子穿梭体或非游离的氢穿梭体来实现，但到目前为止，这个假定的中间体仍不清楚。尽管有人尝试通过添加抑制剂、电子穿梭体（非那烯烃、胡敏酸）或潜在的中间体（氢气、甲酸盐、醋酸盐、甲醇）来使ANME与SRB解偶联，但均以失败告终。 因此，ANME的富集的关键还是其与SRB之间的偶联关系。AOM反应的机制目前还不清楚，期望通过解偶联来实现ANME和SRB的筛选还有很大的困难。 四、关键菌群的分离 由于生长的缓慢和偶联性，使ANME至今无法获得纯培养物。通过单细胞基因组测序、单细胞二次离子质谱（SIMS）、激光镊子细胞分选、荧光激活细胞分选、磁珠分选等新的技术有可能对ANME的基因组和蛋白质组信息进行分析，从而克服细胞培养的需求理解AOM生物化学性质，但对AOM机制、ANME和SRB特性等研究的基础还是获得它们的纯培养物，因此，AOM及其关键菌群的研究还任重道远。 五、其它AOM途径 除SO42-、NO2-和NO3-外是否可能还存在其他AOM的电子受体?在各种水体中往往会含有较多的高价金属和非金属离子，如Fe3+、MnO4-和ClO4-等，从热力学角度分析，这些物质与甲烷反应所释放的能量都较大，因而它们都有可能成为AOM过程的电子受体，AOM过程可能会有更多的代谢途径。 9.6：微阵列技术在不可培养微生物研究中的应用 微阵列（Microarray）是近些年发展起来的一种非常有用的染色体基因组技术，1998年被《science》杂志和媒体评为10项最有突破的技术之一。 该技术是一种新的研究工具，它可以让研究人员从综合和动态的分子角度观察不同生理状况的活细胞中基因的转录、表达。为细胞生长、分化和进化到疾病的发病机理、耐药性和癌症、新药开发、环境治理等研究提供了有效的工具。 一、DNA微阵列的概念 通过自动化的仪器将大量的DNA序列附着在几个平方厘米的固体基质上，包含数千至数万个核苷酸探针的小型化阵列。这些微阵列常被称为微芯片、生物芯片、DNA芯片或基因芯片，但为了与计算机芯片区分开来，统一称之为微阵列。 DNA序列来源：PCR、cDNA、RNA; 1）高通量和平行分析 2）高灵敏度 3）不同标记，同时分析 4）背景干扰低 5）实时数据分析 6）自动化控制 优点 二、DNA微阵列制作—基质 印刻微阵列的基质对整个微阵列实验有很大影响。基质表明处理不好会导致探针不能很好地粘附上，并且不均匀的表明会导致粘附的DNA量的差别；在微阵列制作中残留在表面的物质也会导致高的背景荧光，对分析产生干扰；此外，如果采用高荧光背景的基质，检测的灵敏度会大大下降。因此，选择合适的微阵列实验的基质的非常重要的。基质材料可分为有孔材料和无孔材料。 1、有孔材料 例如，硝酸纤维膜和尼龙膜。 优点：可以在很小的一个区域上固定大量的高浓度样品，实现较高的灵敏度和更好地定量分析；沉淀的样品会通过毛细管立即流入膜中，较易获得均一的点；可以多次重复使用。 缺点：边界和形状不能很好地界定，并且膜在溶剂中会膨胀，干了之后会缩小和变形；许多膜自身有较高的荧光强度；相比于无孔基质，膜上的点不能集中到一点，在制作过程中需要更多的DNA。 2、无孔材料 例如，玻璃和聚丙烯等。 优点：可以让少量的生化分子准确地沉积在表面上而很少地扩散，使得小型化和高密度的微阵列制作成为可能；核酸可置于基质的表面，使得靶向探针分子的杂交速度快；由于膜上没有孔径的限制，杂交没有空间排列的抑制；只要少量的样品就可以实现高的探针浓度、快速的杂交速度和高灵敏度；表面不会吸收试剂，多余的标记物可轻易除去；本身只有很低的荧光强度；具有均一的附着面，实现真正的平行分析。 缺点：灵敏度相对于有孔基质较低，受灰尘和其它空气颗粒的污染。 二、DNA微阵列制作—核酸与基质的连接 连接策略：核酸必须紧紧的连接到基质的表面，并且连接后的核酸分子仍能进行杂交。 1、静电作