第五章_动物细胞工程制药研讨.ppt

一、动物细胞产品常用的纯化方法 二、动物细胞产品的质量要求 第八节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求 下游纯化工作费钱、难度大 成分复杂：工程细胞表达的产品，常常和细胞内容物、培养基成分，特别当采用有血清培养基时小牛血清中的各种蛋白成分都将与产物混杂在一起，这些成分的物化性质常常和目的产物非常相似，因此很难将他们分离开 作用于人体的药物纯度要求高：由于产品多数用于人体，为防杂质对人体的有害作用，对产品的纯度要求很高 大多数动物细胞表达的产物产量低，生物活性不稳定，因此要求纯化过程中所有的操作都应该非常温和、精细，包括溶液的温度、pH和盐离子强度等都需要严格控制，要有相当精密的设备和检测仪器。 由于细胞产品多种多样，它们的氨基酸组成、结构、相对分子质量大小和等电点等都不尽相同，因此分离纯化技术的通用性差，必须根据每一种产品的特点研究开发出适合于该产品的专用的分离纯化技术。 一、动物细胞产品常用的纯化方法 离心（低温离心） 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析 盐析和有机溶剂沉淀 透析 高压液相层析 盐析和有机溶剂沉淀 盐析：溶液中加入无机盐类，破坏蛋白质分子周围的水化膜，使蛋白质溶解度降低而析出。最常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等。调节盐浓度和pH常同时使用。盐析时蛋白不易变性，结束后需要进行透析、超滤脱盐。 有机溶剂沉淀：加入与水可混溶的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，也可使蛋白质沉淀。为了避免蛋白质变性必须在低温下操作。 透析 原理：蛋白质分子较大，不能通过半透膜，可以据此将蛋白质与相对分子质量较小的杂质分开。 高压液相层析（HPLC，high-pressure liquid chromatography） 使用颗粒极细的介质，在高压下分离蛋白质或其他分子混合物的层析技术。 柱效比经典柱色谱柱高。在色谱柱出口处常常配以高灵敏度的监测器，以及自动描记、分布收集的装置，并用计算机进行色谱条件的设定及数据处理。 二、动物细胞产品的质量要求 对工程细胞的要求： 有细胞系的历史资料 有细胞特性的资料 无细菌、真菌、支原体和各种病毒，包括反转录病毒等外来有害因子的污染 生产工艺（细胞培养和纯化工艺）的要求： 对生产厂房、原材料和试剂的要求 对细胞培养的要求 对纯化过程的要求 对产品的质量要求： 产品纯度 产品生物活性 产品比活性：每毫克蛋白质中含有多少单位生物学活性（U/mg） 产品蛋白质性质的鉴定 产品中杂质的检测 产品的稳定性 产品临床前的安全性和有效性评价 产品临床试验的安全性和有效性评价 一、改进表达载体，提高表达水平和产量 二、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本 三、抑制细胞凋亡，延长培养周期 四、采用糖基化工程，提高产品质量 五、转基因动物的研究 六、组织工程的研究 第九节 动物细胞制药的前景与展望 一、改进表达载体，提高表达水平和产量 采用更强的启动子和增强子 更好的利用扩增系统或寻找高表达位点 采用和改造更好的宿主细胞 二、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本 采用代谢工程改造工程细胞 代谢工程，即采用基因工程的手段，使工程细胞增加或减少某种酶，改造它的代谢能力和途径，使其降低对某些营养物质的需要，减少某些代谢产物的产生和危害，以及控制工程细胞的增殖速度和制造产品的能力。 改进培养工艺，降低生产成本 优化培养工艺 三、抑制细胞凋亡，延长培养周期 细胞凋亡：一种由遗传基因决定的程序性细胞主动死亡 防止细胞培养过程中细胞凋亡的三种措施：①通过培养基和氧的优化供应防止营养和氧的缺乏；②用化学添加剂如抗氧化剂等阻断细胞凋亡过程；③采用抗细胞凋亡基因改造工程细胞 四、采用糖基化工程，提高产品质量 蛋白质有两种糖基化方式：N-糖基化和O-糖基化。O-糖链对蛋白质特性影响不大，N-糖链的不同对产品可产生较大的影响。 糖基化工程：用基因工程的手段，人为的改变肽链结构、增加某些酶基因以及改进和控制某些培养条件等，以达到正确糖基化的目的。 五、转基因动物的研究 1982年Palimiter等首次提出用转基因动物来生产药用蛋白。现有α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶Ⅲ和蛋白C等多种产品。 优点：质量高、成本低、产品质量基本上与天然的一样 六、组织工程的研究 组织工程：通过对细胞的大量培养，并用细胞直接作为一种治疗手段用于临床，或用培养的细胞进一步加工构成一种组织，如人造皮肤、人造肝脏、人造胰腺、人造血管和人造骨等，并用于临床治疗。 第三章习题 离体培养的细胞分为哪些类型？ 什么是接触抑制现象? 动物细胞的生理特点 生产用动物细胞的种类及其特点 动物细胞的培养条件 培养动物细胞的培养基的种类和组成 动物细胞大规模培养的方法 微载体需具备哪些条件？ 动物细胞培养的操作方式 灌流式操作的优点 动物细胞生物反应器