AFLP分子标记实验流程要点.docVIP

AFLP分子标记实验 扩增片段长度多态性Amplified fragment length polymorphism（AFLP）是在随机扩增多态性（RAPD）和限制性片段长度多态性（RFLP）技术上发展起来的DNA 多态性检测技术，具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点，不需象RFLP分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。 其基本原理是：以PCR(聚合酶链式反应)为基础结合了RFLP限制性片段长度多态性的分子标记。把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3-PCR扩增，只有那些与3-)，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。18.2MΩ·cm） 2．其他实验需要物品 微量移液枪（一套）及相应尺寸Tip头,PCR管,冰浴等。 实验流程 总DNA提取 使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA，通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。一般来说，100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。 EcoR1酶消化（20ul体系/样品） EcoR1 1ul (10U/ul) 10×Buffer 2ul 37℃ 2hrs 65℃ 30min终止反应 sample(总DNA) 5ul ddH2O 12ul Mse1酶消化（20ul体系/样品） Mse1 2ul（1U/ul） 10×Buffer 2ul sample(EcoR1酶切产物) 15ul 65℃ 2hrs 80℃ 30min终止反应 ddH2O 1ul T4 DNA Ligase（20ul体系/样品）接头退火65度10分钟25度2小时 T4 DNA Ligase 2ul(1U/ul) 10×Buffer 2ul sample(双酶切产物) 10ul Mse1 Adaptor 1ul （不稀释) 22℃ 3hrs 65℃ 10min终止反应 EcoR1 Adaptor 1ul稀释10倍 ddH2O 4ul 预扩增（20ul体系/样品） sample 4ul Primer(Mse1/EcoR1) 1ul (100uM分别稀释14倍) AFLP Core Mix 15ul * AFLP Core Mix 配方： ddH2O 8.8ul MgCl2 1.6ul dNTPs(2.5mM) 1.6ul Taq酶(1U/ul) 1ul 10×Buffer 2ul 预扩增程序： 94℃ 2min 94℃ 20s 56℃ 30s 20cycles 72℃ 2min 60℃ 30min 6、选择性扩增（20ul体系/样品） sample 4ul(预扩增产物稀释20倍) Primer(Mse1-XXX/EcoR1-XXX) 1ul（M引物100uM稀释14倍，E引物100um稀释100倍） AFLP Core Mix 15ul 选择性扩增程序： 94℃ 2min 94℃ 20s 66℃ 30s 每循环降1℃，共10个循环 72℃ 2min 94℃ 20s 56℃ 30s 20个循环 72℃ 2min 60℃ 30min 7、产物电泳检测 上样液：Loading Buffer 20ul Size standard-600 0.2ul Sample 3ul(稀释10倍) 四、实验结果与分析 本实验使用贝克