构建表达载体的实验流程及其注意事项2014-12案例.pptVIP

* 热激转化 手持冰盒到-80 ℃ 冰箱前，取出感受态管，插入冰中。 手指捏感受态管底2-4sec使其融化后，加入连接产物，枪尖温和搅匀，于冰上30min。 42℃水浴90sec（一定要准确，不要时间过长）。 冰浴２min后，加入800μL的LB在37 ℃振荡30～45min。 取200μL涂布于含Amp(50μg/mL)等相应抗生素的 平板， 37℃培养过夜，观察结果 将150mL锥形瓶中放入5～10mL培养基，加入抗生素，挑取菌斑，250转/min振荡培养过夜。（摇菌前可先做菌液PCR） 提取质粒，电泳，酶切 * 重组质粒筛选 1、抗生素筛选法 2、互补法 蓝白斑筛选： PUC系列载体含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。 DH5α含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。 3、PCR、酶切 * 质粒提取：碱裂解法 收获细菌：含有质粒的DH5α、TOP10等 LB可富集2-3次，Teriffic可2次。 溶液Ⅰ： Tris-HCl, EDTA, 葡萄糖 溶液Ⅱ： NaOH, SDS 冰上3-5min，时间过长会： 质粒断裂；羟基化影响酶切 溶液Ⅲ：乙酸钾，冰乙酸 迅速颠倒3次混匀后，置于冰上 TER： （ TE，pH 8.0，含RNase 20μg/mL） 去除RNA * 质粒纯化： 1、PEG纯化 缺点：摇菌液几百毫升，耗时长，步骤繁多 优点：质粒纯度高（不含线状DNA） 浓度大 2、过柱法： 缺点：柱子吸附能力有限，浓度低，纯度差（甚至有RNA） 优点：省时省力 * 质粒的电泳 Marker是酶切片段； 质粒是环形的，还会形成超螺旋结构。 * 质粒验证 1、酶切验证 一般将质粒切成2-3个片段，片段大小是否相符？ 如：连接后酶切的载体片段、目标片段大小与连接前相同？ 2、PCR验证 如：用目的基因引物扩增，检查目的基因是否存在 3、测序验证 最后的选择。 * 2012-03-15 世间无难事， 只怕有心人。 * * * * * * * 2002/12/10 构建表达载体的 实验流程及其注意事项 中国农业大学 梁荣奇 * 把目的基因置于以适当的载体，转化细菌后，筛选所需的细菌克隆。摇菌后可得到大量含目的基因的表达载体 注意事项： -- 选择合适的载体 -- 载体具有适合的酶切点 -- 适合地连接反应 -- 选择适合扩增质粒的菌株 -- 筛选、验证目的克隆 -- 转化对照 * 分子克隆实验若纸上谈兵，似乎轻而易举；但要付诸实践，却又举步维艰，谈何容易。大多数实验都是步骤繁多，若一着不慎，即会陷入困境。 验证每步产物，设置对照以检查每一反应的效率，都是可取的良策。而要对上述问题应对自如，又必须透彻理解每一步实验流程所涉及的实验原理。 ——第一版前言（p11） 《分子克隆实验指南》 第二版 ，1996，科学出版社 * 汇报内容 1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测 * 如何阅读质粒图谱 1、质粒类型和大小（真核/原核/穿梭质粒） 2、复制起点（ori） 3、筛选标记（抗生素标记） 4、多克隆位点（MCS） 5、外源DNA片段的插入（位置、大小、酶切位点） 6、表达系统元件 （启动子—核糖体结合位点/内含子—克隆位点—转录终止信号） * * * 1、杀菌机理： 四环素（tet): 四环素与核糖体30S亚基结合，抑制核糖体的转位。 Tet 抗性基因编码一个399的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 氨苄青霉素（amp)：氨苄青霉素可与细菌膜上一些与细胞壁合成有关的酶结合 并抑制其活性。Amp基因可降解氨苄青霉素。 氯霉素（Cm或cat)：氯霉素与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质的合成。 Cat 基因编码一个四聚体细胞蛋白，催化氯霉素羟乙酰氧衍生物的形成。 卡那霉素（kan)：可与核糖体结合，抑制蛋白的合成。 卡那霉素可被氨基糖苷磷酸转移酶(APH-II)灭活。 2、溶液配制： 一般配成50或100mg/mL，抽滤，-20℃保存备用。 常用抗生素抗性基因 * 遗传转化所用载体（1） 一、基因枪转化 1、对载体类型无选择；