GST_pull_down试验方法(自己总结).docVIP

12.GST蛋白的表达 12.1 GST蛋白的表达1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。 2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0.1。 4) 28℃,220rpm摇菌培养2小时。 5) 加入50μl 100mM IPTG,1627℃摇菌培养18小时。 6) 收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃ 5krpmx5min离心，弃上清。 7) 加入10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。 8) 加入2ml　PBS/管，重悬细胞。转移至5ml离心管。 9) 超声破壁 破壁前，在细胞悬液中加20μl 10mg/ml PMSF,80μl蛋白酶抑制剂(100x)。 破壁参数：Frequency:100200w　60s， pause　20s run 40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。 加100μl 20%　TritonX－100，冰上放置30min。 10) 将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12krpm×10min，取上清。 11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。离心（12krpm,1min），取上清作SDSPAGE电泳，检测表达情况。 准备50%GST Sepharose 4Bslurry1) 将原75%Glutathione Sepharose 4B的slurry弹至混匀2) 取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。 3) 加500μl　PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。反复5次。 4) 加500μl　PBS，颠倒混匀，配成50%Glutathione Sepharose 4B备用。 GST融合蛋白的纯化 1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl 50%Glutathione Sepharose 4B，4℃，摇床上摇，反应30min60min。 2) 3krpm离心5min，弃上清。该Sepahrose上即结合了GST融合蛋白，（如果仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高，可以只接合一次，如果要结合更多则接着往下做） 3) 在管中加入离心后的1.5ml新鲜制备的细胞裂解液的上清，4℃，反应30min60min。3krpm离心5min，弃上清。重复该步骤多次，就可以使Sepahrose上结合610ml 裂解液中的GST融合蛋白。 4) 在管中加入预冷的200μl　PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的联接）,轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤一次， 3krpm离心3min，弃上清。 5) 反复三次（最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余几次可以中枪吸，尽量吸净但不吸走珠子），即获得结合有GST融合蛋白的Sepharose。 6) 如果用于检测，在Sepharose加入1520μl 1×蛋白电泳上样缓冲液，在沸水浴中煮3min。12krpm离心1min，取上清作SDS电泳。 7) 如果用于pulldown测试，参见pulldown 步骤。 1) 将结合有GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B悬浮在500μlNETN缓冲液中加入2030μl含有其他蛋白的溶液，例如pET发酵的产物的产物等，同时采用结合有GST空蛋白的Glutathione Sepharose 4B平行操作作为对照。 2) 在水平摇床上，4晃动48小时。 3) 离心（3.6krpm,2min）。吸去上清，注意不要扰动底层的Sepharose. 4) 加入200μl缓冲液H对Sepharose进行洗涤。注意加入缓冲液H时要贴壁加，不要直接冲击Sepharose，随后轻柔晃动，使Sepharose重悬即可。 5) 低速离心（3krpm，2min）吸去上清，注意不要扰动底层的Sepharose。 6) 重复步骤的洗涤23次。 7) 吸干Sepharose上方的水层后，加入2030μl 1×蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴4min，冻存于－20℃。 8) 做SDS和Western检测另一个蛋白。 （1） Glutathione 琼脂糖珠预处理。 （2） GST融合蛋白挂柱：取适量GST-融合蛋白与10μl已经处理过的beads置于1.5ml离心管中， 4℃, 摇床孵育过夜。 （3） 孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃,500g离心5min，上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上，用1ml冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次beads。 （4） 把转染目的基因的细胞（5×106）裂解在0.5ml细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂），最大转速4℃离心20min,收集上清液。 （5） 将细胞裂解