明胶酶谱与MMP2免疫组化.docVIP

⑶ RIPA 蛋白裂解液： 称取Tris 0.605g、NaCl 0.8775g、TritonX-100 1g、1%脱氧胆酸钠1g、SDS 0.1g，加入60ml 去离子水，盐酸调pH7.5，定容100ml。 ⒂ 明胶酶谱试验孵育液 Tris 2.97g，CaCl2 0.353g， NaN3 0.1g，去离子水400ml，pH7.6，定容500ml。 ⒃ 明胶酶谱试验复性液 2.5ml TritonX-100 加入去离子水100ml。 ⒄ 明胶酶谱试验脱色液 甲醇50ml、去离子水40ml、冰醋酸10ml，混匀，室温保存。 ⒅ 10%明胶储备液 明胶5g，去离子水40ml，加热、磁力搅拌至完全溶解，定容50ml，4℃冰 箱备用。 ⒆ 考马斯亮蓝R250 染液 取甲醇50ml、去离子水40ml、冰醋酸10ml、0.1g 考马斯亮蓝R250，混匀， 室温保存。 ⑵ BCA 法测定组织提取液的蛋白浓度。 采用Pierce 蛋白测定BCA 法试剂盒，按照说明书进行操作。同第一部分。 A．制作蛋白浓度标准曲线 生理盐水稀释蛋白标准溶液，配成梯度蛋白标准溶液浓度分别为：0.00、0.05、 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mg/ml 作液。10μ l 不同浓度的蛋白溶液分别加入96 孔板，加入200μ l 工作液，室温放置30 分钟，测定OD562。以不同浓度蛋白溶 液测得OD562 数值为纵坐标，对应标准蛋白浓度为横坐标，制备蛋白浓度标准曲 线。 B．待测样品蛋白浓度测定 待测样品用生理盐水稀释50 倍。取稀释样品10μl 置96 孔板，与200μl 蛋 白浓度测定工作液（A:B=50:1）混合，室温放置30 分钟，测定OD562，利用蛋 白质浓度标准曲线计算待测样品蛋白浓度。 3.5 明胶酶谱法检测MMP2、9 活性 3.5.1 蛋白样品准备 上述UTMD 后3 天（缺血再灌注后6 天）收集大鼠心脏梗死和边缘区及远 端非梗死区组织匀浆，加入组织裂解RIPA 液（不含蛋白酶抑制剂cocktail），混 匀，置冰上2 小时，13000rpm/分钟、4℃离心20 分钟，取上清获得组织提取液。 BCA 法进行蛋白浓度测定，同前。 3.5.2 明胶酶谱试验 ⑴ SDS（含1%明胶）电泳 取50μg 上述蛋白提取液（不含蛋白酶抑制剂）加入适量5×SDS电 泳上样缓冲液（不含β 巯基乙醇），混匀，至55℃变性10min，室温冷却。取20μg 蛋白样品进行SDS电泳（8%分离胶、含1%明胶，见表4），100V，90 分 钟。 表4 SDS（含1%明胶）凝胶配制 5%浓缩胶 8%分离胶 水 2.82 3 30%丙烯酰胺 0.83 3.3 0.5M pH6.8 Tris 1.25 - 1.5M pH8.8 Tris - 2.5 10%明胶 - 1ml 10%SDS 0.05 0.1 10%APS 0.05 0.1 TEMED 0.005 0.004 总体积 5ml 10ml ⑵ 凝胶复性、孵育 取出上述SDS胶，置明胶酶谱复性液（2.5% TritonX-100）15 分钟， 两次。胶至孵育液，室温15min 后，置37℃、20 小时。 ⑶ 凝胶固定、染色、脱色和拍照分析 取出凝胶置脱色液中固定15 分钟，放入考马斯亮蓝染色30 分钟，然后凝胶 脱色直至 免疫组织化学染色：采取热修复抗原SABC染色程序，切片浸入0．01 mol／L枸橼酸缓冲液，微波炉加热100E 15 min热修复，冷却后0．1 mol／L磷酸盐缓冲液洗涤2次，滴加第二抗体及血清封闭液，室温20 rain，滴加稀释第一抗体，4C冰箱保存过夜，滴加SABC试剂，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水、透明、封片，显微镜观察。采用SP免疫组织化学方法染色组织切片，每次染色时用试剂公司提供的TGF p 1、MMP一2、TIMP一2阳性片作阳性对照，磷酸盐缓冲液代替第一抗体作为阴性对照。TGF D 1、MMP一2、TIMP一2免疫组织化学结果均使用美国IPP5．0专业图像分析软件测定平均吸光度值，用背景的吸光度值减去阳性部位的吸光度值即为阳性部位的吸光度值。