蛋白质分子基础蛋白质制备.pptVIP

蛋白质的脱盐 方法 处理量 操作时间 操作难度 透析 少量或数十毫升 5小时以上 容易 纤维过滤透析 大量样品 0.5 小时 稍难 分子筛 少量或数十毫克 数小时 稍难 蛋白质的浓缩 沉淀法： 用盐析法或者有机溶剂法将蛋白质沉淀，再将沉淀溶于少量溶液中。 吸附到离子交换柱上，然后用少量盐洗脱。 干燥吸附法： 用固体吸附剂如Sephadex G25等，冻干法，真空干燥法。 渗透浓缩法： 将干粉PEG-20000涂在装有蛋白质溶液的透析袋上，可吸干水分。 超滤浓缩法： 用超滤膜滤去小分子和水，达到超滤的目的。 在一定的密封容器，施加一定压力使一定分子量的物质透过超滤膜。 超过滤法 蛋白质溶液 半透膜 支持膜的栅板 超滤液 加压 沉淀法分级蛋白质 蛋白质溶液 蛋白质分子表面带有亲水基团----- 具有水化作用，可以和水结合，进入水溶液当中。 在溶液的pH值偏离等电点时，蛋白质就会带同样的电荷，导致同性相排斥，使蛋白质分子进一步分散。 等电点时整个蛋白质是中性的，水化作用此时最弱，蛋白质的溶解度值最小。 沉淀蛋白质的方法学 破坏蛋白质分子之间的水化作用。 减弱蛋白质分子之间同性相排斥的作用。 沉淀蛋白质的常用方法 盐析法 有机溶剂法 有机聚合物沉淀法 选择性变性沉淀法 盐析法 是一种向蛋白质溶液中加入浓的盐溶液使蛋白质变性的方法。 盐溶：一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加 。 盐析:当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出。原因:将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出,导致蛋白质分子的沉淀。 盐析法 在高盐溶液中，蛋白质溶解度的对数和溶液中离子强度的关系: logS=logS0-KSI，I=sum(MZ2)/2 S0为蛋白质在无盐溶液中的溶解度； S为蛋白质在某一离子强度溶液中的溶解度； I为中性盐的离子强度。 Ks为盐析常数，与溶质的结构、盐的价数有关。 M为溶液中各种离子的摩尔浓度，Z为各种离子的价数。 盐析法 (1)改变盐的I值(KS 分段盐析法): 当盐种类确定后，在一定的pH和温度条件下，利用不同的蛋白质KS不同，改变盐的I值，可以分离不同的蛋白质。各种离子盐析能力的强弱如下： PO43-SO42-C2O42-AC-Cl-NO3-; K+Rb+Na+Cs+Li+NH4+ (2)改变S0的值(β分段盐析法):改变pH 和温度 达到等电点时, S0值最小 S0值随温度增加而降低 ----增加温度有利于蛋白质沉淀 盐析法 蛋白质浓度过高时，蛋白质分子之间容易发生共沉淀作用。因此，盐析时，蛋白质浓度不宜过高。最适的浓度通常在2.5~3.0%之间。 盐析法是根据不同蛋白质在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法. 盐析法 硫酸铵盐析法 盐析能力强，在水中溶解度大：250C时为4.1 mol/L。 不会引起蛋白质的变性。 操作简便，可除去较多杂质。 可浓缩蛋白质，有利于进一步纯化。 价钱便宜。 缺点是分辨能力差，纯化倍数低。 一定体积蛋白质加入饱和硫酸铵的体积数X： aV 100-a X= 有机溶剂法 在蛋白质溶液中加入有机溶剂，可以使蛋白质沉淀。 原理： 1.增大带电质点之间的静电力。 2.破坏蛋白质表面的水合层，使蛋白质分子脱水而沉 淀。 有机溶剂法 选择有机溶剂的原则： 1.必须能与水完全混溶； 2.不与蛋白质发生反应； 3.沉淀效应好； 4.溶剂蒸汽无毒，不容易燃烧。 常用的有机溶剂： 丙酮 乙醇 有机聚合物沉淀法 作用原理与有机溶剂类似。 常用的有机聚合物有： 聚乙二醇 (PEG); 聚丙烯酸，可沉淀带正电蛋白质。 选择性变性沉淀法 适用于提取一些耐极端环境的蛋白质。用一些极端条件，使非目标蛋白质变性析出，从而将目的蛋白质纯化。 主要方法有： 热变性； pH变性(包括等电电变性)； 有机溶剂变性。 适用于提取一些耐极端环境的蛋白质。用一些极端条件，使非目标蛋白质变性析出，从而将目的蛋白质纯化。 主要方法有： 热变性； pH变性(包括等电电变性)；