10.第10章 流式细胞分析.ppt

前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 FALS Sensor Laser 前向散射光示意图 侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。 FALS Sensor 90LS Sensor Laser 侧向散射光示意图 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。 淋巴细胞 单核细胞 中性粒细胞 光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群 荧光信号 激光的作用原理 当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管，光电倍增管将光信号转换成电信号。电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。 常用荧光染料 目前台式机FCM配置 488nm激光管常用染料有 PI (Propidium Iodide)碘化丙啶 PE (Phycorey- thrin)藻红蛋白 FITC (Fluorescein Isothiocyanate)异硫氰酸荧光素 PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein)叶绿素蛋白 PE-CY5化青素 FCM测量数据的存贮、显示和分析 目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物最多可达4个，数据的存贮采用列表排队方式，可节省存贮空间。 数据文件为二进制文件，缺乏直观性，数据的显示常用以下几种方式： 直方图 散点图 等高线图 密度图 三维图 直方图 直方图(Distribution Histogram) 横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是道数，可以是线性或对数坐标。 纵坐标一般是细胞数。 散点图 散点图(Dot Plot) X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。 第三节 流式细胞分析应用 一、淋巴细胞亚群分析 二、DNA分析 三、白血病免疫分型和残余白血病检测 四、网织红细胞分析 五、造血干细胞检测 六、器官移植的配型和免疫状态的监控 七、染色体核型分析 淋巴细胞亚群分析 使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析 各淋巴细胞亚群的百分含量 淋巴细胞亚群的绝对计数 临床意义 了解在不同情况下体内免疫功能状态 辅助临床疾病的诊断 探索疾病的发病机理、病程、预后 监测、指导临床治疗方案 免疫系统疾病 免疫缺陷病，AIDS 移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测 肿瘤病人化疗后免疫力检测 淋巴细胞亚群分析 根据功能，淋巴细胞主要分为 B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK细胞（CD3- CD16+ 56+），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。 FCM的应用——血液病学 白血病和淋巴瘤免疫分型 残留白血病 造血干细胞计数 PNH诊断 网织红细胞分析 血小板分析 血小板膜糖蛋白分子的表达 血小板活化 网织血小板分析 第四节 流式细胞分析仪的 常见故障及维护 仪器的维护 1.激光电源的波动范围应小于±10%。 2.室温在18℃～24℃，相对湿度小于85%。 3.安装单独的可靠的地线。 4.仪器操作必须有经过培训的人员操作。 5.样品和鞘液管道每周应用漂白粉液清洗。 * * 第十章 流式细胞分析 主讲：周振华 流式细胞术的定义：是一种对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的快速定量分析和分选的技术。 第一节 流式细胞分析理论知识 流式细胞仪的定义：是以激光为光源，集流体力学技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的细胞分析仪器。 什么是流式细胞仪 ●流式细胞仪实物 BD FACSVantage BD-Calibur 关键是制备：单细胞悬液。 流式细胞的样本制备技术 流式细胞的检测步骤 1、单细胞悬液 2、对测量细胞进行荧光标记染色 3、流式细胞测量 4、对测量结果进行定量分析 5、对测量结果进行生物医学意义解释 可测量的参数 分为：结构参数和功能参数 1、结构参数：细胞大小、形态、细胞核与细胞质的比值，色素颗粒，亚细胞形态，DNA，RNA，蛋白质含量，细胞表面抗原，碱性蛋白，染色体结构。 2、功能参数：氧化还原酶状态，表面电荷，pH值，膜