电泳步骤V20.docxVIP

安装玻璃板→查漏→制分离胶→画线→注分离胶→注水→制浓缩胶→倒水注胶→制样→沸水加热→注样→浓缩阶段电泳→分离阶段电泳→固定→染色→脱色1.安装玻璃板：注意平整，短板朝内安装2.查漏：用蒸馏水沿内壁注满，静置5-10min3.制12%分离胶：参照配方，注意一定要迅速，使用5ml, 200μl的移液器。加完用胶头滴管轻轻搅拌再滴加。留意温度，必要时可以在冰水中配置4.画线：从长板上沿至下3cm处画线（建议先画线再配胶，不能太低或是高，否则配胶比较麻烦）5.注分离胶：沿内壁迅速注入，注意不能产生气泡（不慎产生气泡可以使用加样器戳破或是吸出），加至画线处停止6.注水：加入蒸馏水至壁沿，慢慢加入，后静置1H（这个时间有待确定，与AP,TEMED,以及室温有关,直至水和胶出现分层线）7.制5%浓缩胶：参照配方，注意一定要迅速，使用5ml,1000μl，200μl的移液器（留意温度，必要时可以在冰水中配置）8.倒水注胶：将水倒出，注意一定要小心。加入浓缩胶。静置30min（时间有待确定，与AP,TEMED,以及室温有关，一定用胶头滴管加，用移液器容易导致凝胶形成出现问题。甚至可以在冷水中操作。具体指示是可以看到梳子可胶出现界限，需要仔细观察 黄行健）9.制样：将蛋白按照目标浓度所需比例加入样品缓冲液10.沸水加热：沸水中加热约4min(使pro降解为亚基)，注意取泡沫让样品管浮起（避免高温炸开，导致样品污染）11.注样：取出梳子（取出时，如果发现“干拔”比较难可以湿拔 ），将整体放入套装塑料盒中，加入电极缓冲液（加入前可以检查PH是否为8.3），液面标准为浸没内板，架子外与其同高（主要是为了防止电泳过程中由于连通器原理导致内液面低于内板 刘思宇）。加样使用加样器，每次取20μl，小心加入，加样后每次用蒸馏水润洗3次。12.浓缩阶段电泳：80v/15ma，设置好后按启/停键开始。注意用冰水水降温（设置时可以根据需要保证某一因素不变,适当调大另一因素，保证恒定 刘思宇）13.分离阶段电泳：100v/30ma，（设置时可以根据需要保证某一因素不变,适当调大另一因素，保证恒定 刘思宇）结束时蓝色条带距下边缘1cm（这个长度也可以灵活确定，因为蛋白质和溴酚蓝的分子量相比很大，甚至可以让溴酚蓝跑离底部 黄行健）14.固定：取出，用水清洗后（注意不要弄烂）放入固定液中，静置1H.（此时可以停留存放较长时间），固定液可以回收使用15.染色：移至染色液中，静置1H（严格控制时间）16.脱色:放入脱色液，第一次可以脱色时间较短，而后每次约30min.直至条带清晰，增加脱色液更换频率可以适当加快脱色分离胶（有套装、有配方，10ML）参考配方加入水：3.3ml30%丙烯酰胺:4ml1.5MTRIS-HCl:2.5ml10%SDS :100μlAP ：100μlTeMED（有毒）：5μl浓缩胶（有套装、有配方，6ml）（实际使用证明存在不足以加满的情况）参考配方加入水：4ml30%丙烯酰胺:1ml1.0MTRIS-HCl:1ml10%SDS :80μlAP ：60μlTeMED（有毒）：8μl样品缓冲液(8ml,4℃保存)使蛋白沉降水：4ml0.5MPH=6.8Tris-Hcl缓冲液:1.0ml（配置时按照所需体积秤取，用HCl调节PH值，既要保证PH，又要保证体积）甘油:0.8ml(比较粘稠，取用时注意体积)用于加大样品密度，使其沉降巯基乙醇;0.4ml（非还原性电泳不加，用水替代）用于使二硫键打开10%SDS:1.6ml（搅拌时注意不要过快，否则容易产生气泡）0.1%溴酚蓝：0.2ml（较难配置0.1%的溴酚蓝水溶液，具体可以参照/link?url=KW5L_JjB3w7LFei7HVBFoXn2ynWQkqFEntM4FB6q95RkIYsnaJ4NUurMBqt9LLUQX0me1D1bMVgNEyUXc8iQUq#2配置）电极缓冲液（1000ml）Tris:3.03gGly:14.14gSDS:1.0g溶解后加入1000ml量筒中，定容至1000ml固定液（200ml）异丙醇：50ml乙酸：20ml水：130ml染色液（1000ml）考马斯亮蓝R-250:1.0g甲醇：250ml乙酸：100ml定容至1000ml脱色液（200ml）乙醇：50ml乙酸：20ml水：130ml