《蛋白质与酶学》蛋白质工程.pptVIP

一、蛋白质工程概念及原理 1981年美国基因公司的Ulmer提出的。 通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学的研究获取有关蛋白质物理、化学等各方面的信息，在此基础上对编码该蛋白质的基因进行有目的的设计、改造、并通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终将其投入实际使用。 二、改造现有蛋白质的步骤 分离纯化 氨基酸序列测定、X射线晶体衍射分析、核磁共振分析等 设计核酸引物或探针，获取编码该蛋白质的基因序列 设计改造方案 对基因序列改造 选择合适载体，进行表达 分离、纯化、功能检测表达产物 三、常用技术 定点诱变技术 即专一改变基因中某个或某些特定氨基酸的技术，可以产生具有工业上和医药上所需性状的蛋白质。 四、蛋白质改造包括的方面 酶促反应的Km与Vmax ——反应的催化效率； 蛋白质的pH或温度稳定范围——蛋白质的作用条件； 酶在非水溶剂中的反应性——蛋白在非生理条件下产生作用； 某种酶使其不再需要加入辅助因子——简化持续生产过程； 提高酶对底物的亲和力——增强酶的专一性，减少不必要的副反应； 增强蛋白质对胞内蛋白酶的抗性——简化纯化过程，提高产率； 改变酶的别构调节部位——减少反馈抑制，使产物的产率提高； 提高蛋白质的抗氧化能力； 根据需要改变酶的底物专一性； 改变蛋白质发生作用的种属特异性。 五、经验性的规律 疏水性氨基酸——蛋白活性中心区域 α螺旋和β折叠——结构支架 环区、转角和带电荷区域——蛋白质表面 在设计突变时要保留pro和cys残基 Pro——终止α螺旋区； Cys——稳定二硫键；二硫键又是许多分泌性 蛋白的标志。 保留保守残基 保留潜在的N糖基化位点（Asn-X-Ser/Thr-X-Pro）中的Asn、Ser或Thr。 含有内含子的序列，可以删除某一外显子或外显子组合，不会影响蛋白质其余部分的正确折叠。 两个同源蛋白的嵌合体：结合部位落在具有相同或相近功能的氨基酸序列中 两个非同源蛋白组成嵌合体：结合部分尽量位于所预测结构的边缘。 基因序列中随机插入六聚体接头以鉴定功能性结构域。 缺失突变：避免直接利用天然存在的限制性酶切位点进行删除，破坏正确的ORF，或缺失突变体边界不能落在适当的位置，而使蛋白质不能正确折叠。 常用的方法 将基因插入双链形式的M13噬菌体载体中，分离出单链形式（M13正链）的重组载体，与一段合成的寡核苷酸混合，该链可以与克隆基因的一段序列互补，但只有要改变的那个核苷酸不同。 例如：要把ATT(Ile)突变CTT(Leu)，当寡核 苷酸链大大多于M13DNA，而错配又位于寡核 苷酸链的中部时，在低温、高盐条件下二者 混合，就可以形成配对。 蛋白质改造实例 一.提高T4溶菌酶的热稳定性 在蛋白质分子中导入二硫键。 其作用如下： 1.一般不易去折叠； 2.热稳定性较高； 3.在有机溶剂或非正常生理条件下也不易变性。 将突变基因在大肠杆菌中进行表达，纯化突变蛋白，然后测定其酶活与热稳定性。 蛋白质的热稳定性通常用蛋白质总体结构的50%发生变性是的温度来表示， 蛋白质的变性程度由蛋白质在溶液中的圆二色性来测定。 T4溶菌酶及其6个突变体的性质 二.对酵母磷酸丙糖异构酶的改造在高温条件下，Asn→Asp,Gln→Glu，导致肽链局部构象发生改变，从而使蛋白质失活。 3.把Asp、Cys和Met替换掉可以防止失活现象的发生，从而提高热稳定性。 如枯草芽孢杆菌中替换了六个氨基酸，每个 氨基酸替换可提高稳定性1.25-5.43kJ/mol,6 个同时替换，热稳定性则提高到15.884kJ/mol。 四.提高重组β干扰素的专一活性和稳定性人的β干扰素(IFNβ)的cDNA在大肠杆菌中表达，产物的抗病毒活性为106U/mg,只有天然糖基化蛋白的10%。 六.改变酶的动力学活性 底物浓度对酶促反应速度的效应示意图 酶促反应中酶-底物复合物和产物的形成时间示意图 枯草杆菌蛋白酶的Met222被其它氨基酸替换后的动力学常数 第222位的Met替换Ala或Cys后，枯草杆菌蛋白酶对氧化作用的抗性 A.1.0mol/L的过氧化氢处理 B.0.1mol/L的过氧化氢处理 八.提高酶的活性 嗜热脂肪芽孢杆菌的Tyr-tRNA合成酶的突变 野生型与突变型Tyr-tRNA合成酶的氨酰化活性的比较 九.改善酶的特异性 对葡萄糖菌核酸酶的突变改造示意图 十.提高蛋白质的生物学活性1.改变组织型纤溶酶原激活剂的药用动力学特征 经过11min输液后兔子血液中正常tPA和点突变的tPA的清除速率 3.胰岛素的蛋白质工程 三.提高蛋白质热稳定性的其它方法 1.Gly没有β碳原子，Gly→Ala可以提高