《蛋白质与酶学》蛋白质与酶学--绪论.pptVIP

(a)牛血清白蛋白的近紫外吸收光谱 (b)细胞色素P450近紫外和可见吸收光谱 (c)绿豆胰蛋白酶抑制剂的近紫外吸收光谱 盐溶—盐析 等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶 原因？ 盐析 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出 原因？ 实验室液液萃取过程 分子质量最大的蛋白质分子不能进入载体的 孔隙中，在层析时被最先洗脱，此后是不同 分子质量的蛋白质，由大至小被依次洗脱。 同样分子质量的分子，则是线状分子在前， 球状分子在后。 Kd=(Ve— Vi)/( V0—Vi) 与标准样品的分子质量的对数成线性关系. 一般情况是高盐浓度下，使疏水物质吸附， 降低盐浓度，其至用水使在疏水柱上附着的 样品解离。除了盐浓度外，pH、温度和去垢 剂更也能对疏水层析起作用。 疏水层析在膜蛋白的研究中，还有另一个优 点。因为通常的膜蛋白在与某些特定的去垢 剂相结合后更为稳定，有时它们的活性还依 赖与某种去垢剂的存在，因此，利用疏水层 析可以帮助膜蛋白转换结合的去垢剂。 它们在凝胶中泳动的速度与蛋白质本身的电 荷无关，而是取决与蛋白质的分子量。因 此，SDS—PAGE不仅可用于蛋白质样品的分离 和鉴定，而且也被广泛地用于蛋白质分子量 的估测。 染料树脂是一种不专一的亲和介质，其特点 只可与很多物质非常稳定地结合。它可与许 多类型的酶结合，但又不被酶所作用，而且 价格低廉，但其作用原理不清楚。 染料树脂也可用于血浆蛋白的分离。 3种较通用的技术: (1)免疫亲和层析 (2)凝集素亲和层析 (3)染料亲和层析 而这些离子的配位价还未饱和，为此，离子 还可以和蛋白质等生物分子形成配位键， 不同的生物分子形成的配位键的强度不同， 从而可起到分离纯化的作用。 该层析不仅可以分离纯化转铁蛋白和铜蓝蛋 白等含有金属的蛋白，而且可以分离不含金 属的蛋白质，如α2巨球蛋白。 最后，再用适当的条件断裂配基和连接上的 分子之间的二硫键，就能洗脱并回收到具有 游离巯基的物质。 在选择所用的方法时，应该尽可能地选用不 同原理的分离方法，并加以组合；或选用 类似的方法，但是要改变分离条件。 通常以电荷为基础的分离方法与以分子质量 为基础的方法组合后，就可以得到满意的结 果。 蛋白质的不均一性还表现在肽链的交联上。 有些肽链中存在着没有形成二硫键的、侧链 巯基游离的半胱氨酸，这些巯基可以发生交 联，导致肽链的多聚化。 交换层析从离子交换层析中的非共价键扩展到巯基交换层析中的共价键。有机汞（如对氯汞苯甲酸等）可专一性地和巯基化合物反应，所以，以有机汞化物为配基的载体可有效地分离纯化含有游离巯基的分子。 （八）蛋白质分离方法的多重性 事实上，在实验过程中所用的层析经常是几种因素结合在一起的，很少有一种层析过程只有单一的因素在起作用。 二、蛋白质分离纯化的一般原则 （一）分离对象的检测 应该能“看到”和“识别”要分离得到的蛋白质，或是从它的分子质量加以“识别”，或是通过特征的吸收光谱“看到”它们，最重要的是从它的生物活性上加以“识别”。 （二）分离方法的分类和选择、组合和优化 如果原料充足，可以用盐析之类以溶解度为基础的分离方法，超滤也可以作为首选的方法。 1．疏水层析 不同蛋白质表面的亲水和疏水的平衡情况也是各自不同的。因此，如果在载体基质上接有疏水的基团，就可能在一定条件下和某些生物分子中的疏水部位相互作用，从而能达到分离和纯化的目的。 疏水层析原理 疏水配基可以是直链的烷基，也可以是芳香族的苯环。目前广泛使用的反相HPLC柱是疏水层析的类型。烷基化的反相层析柱主要用于肽类的分离，而苯基的载体却被用于蛋白质的分离。 2．SDS—PAGE电泳 在进行SDS—PAGE操作前，通过带有长脂肪链的SDS和蛋白质中的残基通过疏水作用并按1.4：1的比例结合后，蛋白质本身的电荷已被表面结合的SDS所覆盖，所以与SDS结合的蛋白质几乎带有相同的电荷. SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 导致： 1、由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。 2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成正比变化。 因为利用SDS—PAGE测定的蛋白质的分子质量通常存在着约10%的偏差。如含糖较高的蛋白质，一般表面的亲水性更大些，因此，实际上与SDS的结合量会低些，所以它们在凝胶中的泳动速度就会滞后，结果表现为分子质量偏大。 简单蛋白质组成氨基酸中亲水和疏水氨基酸的比例不同，从而影响到与SDS结合的比值。有些亲水性氨基酸残基比例较高的蛋白质，估测到的分子质量偏大。特别是一些分子质量不大的小肽，如果亲