动物细胞原代培养过程.ppt

动物细胞原代培养过程 动物细胞原代培养 一、剪取组织 颈椎脱臼法处死小鼠，放在100ml的烧杯中用70％乙醇消毒3min。用剪刀剪开腹部，取出肾、肝、脾（任意一种脏器）。 1、将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1‰ 新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。 2、将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔 二、 清洗 在盛有PBS 液平皿中洗涤数次，剔除包膜、结缔组织，将剔除后脏器放入另一盛有PBS平皿中。 三、剪切 将肾、肝、脾剪成1mm3 （剪成肉末状）大小的组织块，再次清洗，洗去残留的血细胞，以备消化。 四、消化 1、在50ml离心筒中加入0. 25％胰蛋白酶溶液25ml，在温暖的环境中或置于37 °水浴摇床中轻轻摇动15min，转速约为180r/min。 2、让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶。（小牛血清在共用无菌操作台上取用） 3、 在离心管中残留未消化组织块中再次加入胰蛋白酶进行消化，重复步骤1和2。 五、制备单细胞悬液 1、将混合的细胞悬液离心，1200rpm，5min，弃上清。 2、将沉淀用新鲜的无菌PBS重悬， 再1000-1200rpm，5min离心。 3、用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止,然后再按照（1）进行离心，离心后弃去上清液，将沉淀用少量细胞培养液反复吹打。制的细胞悬液。 六、接种 1、将细胞悬液接种到细胞培养瓶中。 2、用滤器过滤RPMI1640再悬沉淀，并使终体积为20ml。 七、培养 1、在培养瓶外做好标记（标明所培养细胞的名称和时间）， 2、置于CO2的孵箱中培养， 3、 72h后即可观察。 谢 谢 RPMI1640 RPMI-1640RPMI是Roswell Park Memorial Institute的缩写，代指洛斯维.帕克纪念研究所。 RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。其中含有10%胎牛血清。 * * 取材 漂洗 剪切 消化 制备单细胞悬液 培养 接种 返回 *