生物大分子提取技术.pptVIP

3. 酚抽提纯化DNA： 冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿﹕异戊醇（24﹕1），上下转动混匀，5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。 4. 沉淀DNA： 加入1/5体积的3mol/L NaAc及2倍体积的冷无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5 ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，5000g离心5min洗涤DNA，弃上清。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液适量溶解DNA ，DNA完全溶解通常需12-24小时。 5. DNA的浓度测定及纯度判定： 取DNA溶液用TE液做适量稀释，以TE液作空白对照，在紫外分光光度计上读取A260和A280的光密度值。按下面公式计算浓度： DNA浓度(ug/ul)= A260*50*稀释倍数/1000 DNA纯度的判定： A260/A280 比值应介于1.7-1.8之间。 人基因组DNA RNA的提取纯化 意义： 完整RNA的提取和纯化，是进行RNA研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等实验的前提。 关键点: １）样品细胞或组织的有效破碎； ２）有效地使核蛋白复合体变性； ３）对内源ＲＮＡ酶的有效抑制； ４）有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离； 5）对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。 RNA的提取途径： 1)提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；该提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前已很少使用。 2)直接在酸性条件下用酚-氯仿抽提，异丙醇沉淀，再用乙醇洗涤沉淀，即可去除几乎所有残留的蛋白质和无机盐 。 因为酸性条件下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。 举例：组织（细胞）总RNA提取 1 、 试剂耗材准备 RNA提取缓冲液：4M 异硫氰酸胍、25mM 柠檬酸钠 、100mM β-巯基乙醇； 饱和酚：氯仿：异戊醇（50：49：1）； 3M 醋酸钠 pH5.2； DEPC处理的去离子水：0.5% DEPC的去离子水，充分摇匀，放置4小时以上，蒸汽高压灭菌，分装成小份； RNA酶抑制剂； 15ml、1.5ml等离心管，0.1%DEPC浸泡过夜，蒸汽高压灭菌 。 2 操作步骤 1）将10-30mg组织加入1ml RNA提取缓冲液，匀浆化；或将1ml RNA提取缓冲液加入1瓶培养细胞（10E6-10E7细胞），充分混匀，并使细胞裂解； 2）4℃/12000rpm离心10分钟，上清转移到另一干净的离心管； 3）加入等体积饱和酚：氯仿：异戊醇，混匀，冰浴10分钟； 4）4℃/12000rpm离心5分钟，小心转移水相； 5）氯仿：异戊醇抽提一次，转移水相； 6）加入1/10体积的3M 醋酸钠和2.5倍无水乙醇，混匀，冰浴1小时； 7）4℃/14000rpm离心10分钟； 8）弃上清，75%乙醇洗一次，真空干燥20分钟； 9）加入20-50ul DEPC处理水溶解RNA，可加入少量RNA抑制剂；或加入1ml 乙醇和 1/10体积3M 醋酸钠（pH5.2），-20℃--70℃保存 核酸的纯化 1、粗分级分离 从细胞中提取得到的核酸，常混杂有蛋白质及各种大小的核酸同类物等杂质，可采用适当方法进行粗提纯。 粗提纯中，进一步将蛋白质除去,可用去污剂或有机溶剂多次反复提取。 从RNA除去混杂的DNA，可用DNase将DNA降解掉。 从DNA中除去混杂的RNA，可用RNase将RNA降解掉。 2、精分级分离 核酸样品进行精提纯，一般常用超离心、电泳、柱层析等方法。 超离心包括速度区带离心、沉降平衡超离心。 电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳。 前者凝胶孔径小，适合分离1000个核苷酸以下的核酸分子。后者孔径大，适合分离较大的核酸分子。 柱层析主要有凝胶过滤柱层析、离子交换层析、羟基磷灰石柱层析。 3、纯度鉴定： 核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收（A260/A280）等方法。 RNA的浓度测定及纯度判定：取RNA溶液用DEPC处理的纯水做适量稀释，以纯水作空白对照，在紫外分光光度计上读取A260和A280的光密度值。按下面公式计算浓度： RNA浓度(ug/ul)= A260*40*稀释倍数/1000 RNA纯度的判定： A260/A280 比值应介于1.8-2.0之间。 一、蛋白质（酶）的分离纯化 蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子特异