LHR真核表达载体构建及表达.docVIP

LHR真核表达载体构建及表达 【摘要】 目的 构建黄体生成素受体（LHR）真核表达质粒载体和建立稳定高表达LHR的乳腺癌细胞株。 方法 Kpn/HpaⅠ双酶切LHRcDNA质粒载体获得目的基因，定向克隆构建pcDNA3.1(+)真核表达载体，酶切图谱和序列分析鉴定；重组质粒载体经脂质体转染MCF7乳腺癌细胞，G418筛选，RTPCR、细胞内cAMP测定，筛选鉴定高表达LHR MCF7细胞。 结果 重组质粒pcDNA3.1(+)LHR酶切图谱分析结果、序列分析证明pcDNA3.1(+)LHR载体中LHR序列与GenBank的LHR基因序列完全相符。RTPCR检测MCF7细胞LHR mRNA，MCF7细胞内cAMP浓度测定，证实MCF7细胞高表达LHR。 结论 构建并转染pcDNA3.1(+)LHR真核表达载体，在MCF7细胞中稳定表达，为探讨hCG对乳腺癌细胞的作用提供实验基础。 【关键词】 受体, LH； 绒毛膜促性腺激素； 乳腺肿瘤； 克隆细胞； 遗传载体； 基因表达RNA, 信使 人绒毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotropin，hCG)是胚胎滋养层细胞分泌的一类具有重要生理功能的糖蛋白激素，通过与黄体生成素受体（lutEinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor，LHR）结合发挥生物作用[1]。近年的研究发现乳腺细胞存在hCG受体，因此有学者认为妊娠期hCG对乳腺细胞的直接作用可能与生育后妇女乳腺癌发生率降低相关[24]。笔者通过建立高表达LHR的乳腺癌细胞株，探讨hCG对乳腺癌细胞的直接作用，以提供实验细胞模型。 1 材料与方法 1.1 材料 MCF7乳腺癌细胞购自 中国 科学 院上海细胞生物学研究所细胞库。含LHRcDNA的质粒载体由美国Louisville大学Zhenmin LEI教授提供。胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；DMEM培养基、G418、质粒载体pCDNA3.1(+)、pEGFP、脂质体转染试剂LipofectamineTM2000、RNA Trizol（美国Invitrogen公司）；限制性核酸内切酶Apa（美国Promega公司），限制性核酸内切酶Kpn及Nhe（美国纽英轮生物技术有限公司）；1Kb DNA ladder Marker、小抽质粒抽提试剂盒（上海申能博彩生物科技有限公司）；大抽质粒抽提试剂盒Hispeed plasmid midi kit(25)（德国QIAGEN公司）；RTPCR试剂（日本TaKaRa公司）；cAMP EIA kit（美国Cayman公司）；hCG（美国Sigma公司）。引物合成与测序由上海英骏生物技术有限公司完成。 1.2 方法 参照 文献 [56]。 1.2.1 构建pcDNA3.1(+)LHR重组质粒 Kpn/HpaⅠ双酶切LHRcDNA质粒载体、Kpn/EcoR V 双酶切pcDNA3.1(+)载体，琼脂糖电泳分离，胶回收纯化，T4DNA连接酶将pcDNA3.1(+)载体与LHRcDNA片段连接，构建的重组质粒命名为pcDNA3.1(+)LHR，具体操作步骤按说明书。按常规方法将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素（100 μg/mL）LB平板挑取单克隆，于2 mL LB培养扩菌，小量快速抽提试剂盒抽提载体质粒。应用酶切图谱分析方法鉴定，选取酶切图谱分析结果鉴定的2个克隆载体DNA送上海英骏生物技术有限公司进行DNA序列测定。pcDNA3.1(+)LHR质粒载体在含100 μg/mL氨苄青霉素的液体LB中大量培养，用Hispeed plasmid midi kit抽提质粒。 1.2.2 重组质粒转染MCF7细胞 将MCF7细胞按每孔2×105接种于24孔细胞培养板（美国corning公司），24 h后按每孔0.4 μg及1 μg分别将pcDNA3.1(+)LHR重组质粒及空载体质粒以LipofectamineTM2000转染入MCF7细胞，具体操作按试剂说明书。 1.2.3 筛选转染细胞 转染24 h后，加入400 μg/mL G418筛选转染细胞，每隔2 d换液，直至出现细胞克隆。用胰酶消化，在显微镜下挑取克隆，移至24孔板继续培养，G418筛选，并再次挑取单克隆细胞，大量培养。 1.2.4 鉴定转染细胞 1.2.4.1 RTPCR鉴定 根据已发表的LHR基因序列（NM 013582）设计并合成引物。引物序列： F：5ACAGCTGCTGGTGCTGGCAATG3’ R：5TCCCTTGGAAAGCGTTCCCTG3’ RTPCR两步法扩增500 bp LHR目的片段，扩增条件如下：反应经9