RNA干扰对人瘢痕疙瘩成纤维细胞TGFβ1刺激后胶原合成的影响.docVIP

RNA干扰对人瘢痕疙瘩成纤维细胞TGFβ1刺激后胶原合成的影响 【摘要】 目的体外构建结缔组织生长因子（CTGF）序列特异性小干扰RNA表达载体，转染导入后研究其对人瘢痕疙瘩成纤维细胞（HKFs）胶原蛋白分泌的影响。方法体外构建CTGF序列特异性小干扰RNA质粒表达载体，Dosper脂质体转染人瘢痕疙瘩成纤维细胞后，观察加入10 ng/mL剂量的转化生长因子（TGFβ1）刺激前后胶原蛋白水平的变化。结果转染小干扰RNA质粒后，胶原蛋白分泌水平降为正常表达的51.6%；经TGFβ1刺激后，蛋白表达仍无明显变化。结论小干扰RNA质粒表达载体可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原蛋白分泌，为临床上瘢痕疙瘩的基因 治疗 提供理论依据。 【关键词】 RNA干扰；人瘢痕成纤维细胞；胶原蛋白；转化生长因子β1 Abstract: Objective To investigate the effect of small interfering RNA(siRNA) expressing plasmids targeting connective tissue growth factor(CTGF) on collagen secretion in human keloid fibroblasts(HKFs). Methods Constructed siRNAexpressing plasmids targeting CTGF were transfected into HKFs by Dosper package. The collagen level was measured by 3Hproline incorporation method before and after HKFs were stimulated by transforming growth factor(TGFβ1) of the dosage of 10 ng/mL. Results The collagen level was only 51.6% of the normal level and had no obvious change even after stimulated by TGFβ1. Conclusion The downregulation of collagen by constructed siRNAexpressing plasmids may be a new way to treat keloid. Keywords: RNA interference; human keloid fibroblast; collagen; TGFβ1 瘢痕疙瘩（Keloid，KD）是皮肤损伤如创伤、烧伤或手术后引发的以胶原过度沉积于真皮和皮下组织为特征的过度瘢痕化，其发病机制是异常表达的转化生长因子（TGFβ1）通过结缔组织生长因子（CTGF）促进病理性瘢痕的形成［1］。已有研究表明,TGFβ是一类具有多种生物学功能的蛋白多肽类物质,在创伤愈合的所有阶段均发挥了重要作用［2］。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由双链RNA（doublestrands RNA，dsRNA）介导的基因沉默技术，通过长度21～23个核苷酸的双链小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)与细胞内相对应的mRNA结合，特异性降解mRNA，抑制蛋白表达，具有特异性、高效性和方便性等显著特点［23］。本研究旨在将体外构建的结缔组织生长因子siRNA表达载体转染导入人瘢痕疙瘩成纤维细胞（HKFs）后，观察TGFβ1刺激前后细胞外胶原蛋白分泌水平的变化，为瘢痕疙瘩的基因治疗提供依据。 1材料与方法 1.1材料 质粒pGenesil1（武汉晶赛生物公司），Dosper脂质体（Roche，德国），DMEM高糖培养基（Gibco，美国），液体闪烁仪（SN6930，上海）。 1.2方法 1.2.1细胞培养选用瘢痕疙瘩患者（诊断标准参见 文献 ［4］）术中切除的组织，用组织法分离HKFs，加入10%小牛血清的DMEM培养基，培养条件为37 、5%CO2，胰酶消化传代，取体外培养第5代细胞。 1.2.2siRNA表达载体的构建、鉴定和转染方法详见文献［5］，本实验采用抑制效率最高的靶序列进行转染。转染细胞分为重组质粒组和空质粒组，每组各5份细胞样本。 1.2.33H脯氨酸（3Hpro）渗入法检测胶原蛋白将3Hpro原液配成20×稀释的使用液，在每组细胞中加入20 μL，37 、5%CO2培养6 h。弃去培养液，每孔加入0.5 mL冰预冷的10%TCA，4 固定30 min后弃去TCA。用冰预冷的PB