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KiSS 1基因重组真核质粒的构建、鉴定及其表达 作者：徐玫芳 臧盛兵 黄爱民 刘景丰 高凌云 高美钦 【摘要】 　　目的 构建KiSS1基因重组真核质粒，将其导入人高转移肝癌MHCC97H细胞中，获得瞬时表达的细胞株，为进一步研究KiSS1基因对人肝癌细胞侵袭转移的影响奠定基础。 方法 Trizol试剂法提取新鲜胎盘组织总RNA，经RTPCR扩增目的片段，PCR产物及真核表达载体分别双酶切后进行连接，并转化入大肠杆菌Ecoli.Dh5α扩增以获得重组载体，采用脂质体介导转染技术将高纯度的KiSS1质粒转染到人高转移肝癌细胞株中，用RTPCR和Western blot技术加以鉴定。 结果 RTPCR获得预期大小的特异性DNA片段，经PCR、双酶切鉴定及测序，证实已将KiSS1基因cDNA片段正确插入真核表达载体中;RTPCR、免疫细胞化学和Western blot证实KiSS1基因已转染入MHCC97H细胞中。 结论 成功获得pcDNA3.1/HisC/KiSS1重组质粒和瞬时表达KiSS1基因的肝癌细胞，为后续建立稳定转染的KiSS1高表达阳性细胞克隆奠定基础，为体内外实验研究KiSS1对人肝癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响提供前提条件。 【关键词】 肿瘤抑制蛋白类 遗传载体 转染 肝肿瘤 肿瘤侵润 真核细胞核 质粒 　　肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，居男性恶性肿瘤第3位，病死率高，为恶性肿瘤的第二死因[1]。HCC易发生早期侵袭转移，是患者术后高复发乃至死亡的主要原因。KiSS1作为一个肿瘤转移抑制基因，在很多肿瘤的侵袭转移过程中起重要作用[23]，但在与肝癌关系的研究中，国内外部分学者发现其与肿瘤转移抑制作用存在相悖[45]。因此深入研究KiSS1基因的表达与HCC侵袭、转移及预后的关系很有必要。为此，笔者利用基因克隆技术构建了真核表达载体pcDNA3.1/HisC/KiSS1，并将其导入人高转移HCC MHCC97H细胞中，获得瞬时表达的细胞株，为后续建立稳定转染的KiSS1高表达阳性细胞克隆奠定基础,为体内外实验研究KiSS1对人HCC细胞增殖、侵袭和转移能力的影响提供前提条件。 　　 1 材料与方法 　　1.1 材料 新鲜胎盘组织来源于福建医科大学附属第一 医院 妇产科正常分娩的胎盘;大肠杆菌Ecoli.Dh5α、真核表达载体pcDNA3.1/HisC由福建医科大学分子医学生物中心惠赠;Trizol试剂及脂质体Lipofectamine 2000为美国Invitrogen公司产品;RTPCR逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶(Xho I, BamH I)、T4 DNA连接酶为美国Fermentas公司产品;质粒大量抽提试剂盒为北京Tiangen公司产品;兔抗人KiSS1为美国Santacruz公司产品;Elivision plus二抗试剂盒为福州迈新生物技术开发公司产品;细胞裂解液为美国Pierce公司产品;PCR引物：根据Gene Bank中查到的KiSS1的mRNA序列，用软件Primer Premier 5.0设计上下游引物，由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下(划线部分分别是BamH I和Xho I的碱基识别序列，斜体部分为保护序列)： 　　上游：5′CCAGGATCCATGAACTCACTGGTTTCTTGG3′ 　　下游：5′AGACTCGAGTCACTGCCCCGCACCTG3′ 　　1.2 方法 　　1.2.1 重组真核质粒的构建与鉴定 　　1.2.1.1 RTPCR扩增目的片段KiSS1基因 取50 mg冷冻的新鲜胎盘组织Trizol试剂法提取总RNA，经紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性;所得RNA用Fermentas逆转录试剂盒将其逆转为cDNA，并将其通过PCR法进行扩增，产物行凝胶电泳，目的片段按胶回收试剂盒说明书行胶回收纯化，-20 保存。 　　1.2.1.2 KiSS1和真核表达载体pcDNA3.1/HisC的酶切与连接 0.2 mL离心管中依次加入BamH I 1 μL、Xho I 2 μL、Buffer BamH I 2 μL及KiSS1 DNA 15 μL，37 水浴过夜，加入6×上样缓冲夜4 μL进行琼脂糖凝胶电泳，将酶切的产物胶回收。BamH I、Xho I双酶切质粒pcDNA3.1/HisC，步骤同上。将上述回收产物加入如下反应体系：10×连接缓冲液2 μL，T4 DNA连接酶1 μL，双酶切KiSS1 9 μL，双酶切pcDNA3.1/HisC 8 μL，终体积20 μL，4 连接过夜。取上述连接产物10 μL转化至150 μL感受态大