间接免疫荧光试验11.12.ppt

间接荧光免疫实验 2013307341 叶苹苹 一、原理 根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 二、常见荧光素特性 1)FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。 2)RB200：橘红色粉末，吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红色荧光。 3)TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm，橙红色荧光。 4）镧系：Eu、Tb 5)PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色荧光。 6）其它：酶作用后产生荧光物质。 三、分类 直接免疫荧光法 间接免疫荧光法 四、应用 将病毒接到敏感细胞上进行增殖复制，待病价最高的时候进行间接荧光免疫实验 用于分毒时，确定有无病毒的存在 测抗体 五、优缺点及注意事项 优点：特异性高、敏感性高、速度快 缺点：非特异性染色 注意事项： 1、每次试验应设阳性和阴性对照 2、应注意荧光抗体的质量 3、标本应避光保存 六、操作步骤 1、病毒吸附：5%cpv同步接毒，3d 2、丙酮固定：80%丙酮，4 ℃,1h 3、洗涤：用 PBS 洗涤3遍 ∕ 3min 4、加入一抗：加入抗 CPV 阳性血清（1：100倍稀释），200μL/孔，37℃湿盒中作用 3h 5、洗涤 6、加入二抗：加入 FITC 标记羊抗鼠 IgG 二抗（1:300倍稀释）50μL，37℃闭光作用 1h； 7、洗涤 8、镜检：荧光显微镜观察，拍照，有绿色荧光者判为阳性，无荧光者判为阴性。 七、图示