肠球菌氟苯尼考耐药相关基因的检测.pptVIP

肠球菌氟苯尼考耐药相关基因的检测 杨文哲 2008届药物制剂2班 前言 材料与方法 结果 分析与讨论 参考文献 前言 20世纪80年代以来，肠球菌严重感染的发生率和病死率明显升高，并且由于肠球菌的固有耐药和获得性耐药，使许多常用抗菌药物在治疗肠球菌感染时失败。 氟苯尼考耐药肠球菌的出现引起了越来越多专家的关注，其相关耐药基因fexA,fexB,cfr。 本次试验是通过检测这些耐药基因，为研究氟苯尼考耐药肠球菌的流行病学特征提供依据。 材料与方法（1） 菌株： 29株肠球菌样品(牧医工程学院实验室分离保存)。 试剂：氟苯尼考、 麦康凯培养基 、 琼脂糖 脑心浸出液肉汤（BHI） 细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）等。 仪器：稳压稳流电泳仪 （DYY-4型） PCR扩增仪（2720型） 紫外可见透射反射仪（WFH-201BJ 型） 凝胶成像仪（AlphaImager EC 型） 立式压力蒸汽灭菌器（LS-B35L-I 型）等。 材料与方法（2） 方法步骤 菌株分离 琼脂平板细菌划线法 融化培养基：麦康凯培养基放入立式压力蒸汽灭菌器中融化并灭菌。 倒平板：待培养基冷却至50℃左右，按无菌操作法倒平板(每皿约15m1)， 平置，待凝固。 分区划线：在皿底将整个平板划分成四个面积不等的区域。各区之间的交角应为120℃左右。 菌株鉴定与耐药菌株筛选 鉴定：基因FG为肠球菌菌属所特有。通过特异性引物设计，基因组DNA提取，应用PCR扩增技术和琼脂糖凝胶电泳法，证实FG阳性或阴性来达到相应的目的。 筛选：配制氟苯尼考溶液1.3mg/ml，摇匀备用。在净化工作台上分装于29个BHI肉汤试管中，各16μL，接种肠球菌菌株样品，置于37℃，190 r/min的摇床中过夜培养，观察是否有白色沉淀生成。 基因组DNA提取 进行菌株鉴定的29株肠球菌样本，以及筛选出的氟苯尼考耐药肠球菌均使用细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取DNA ，按照说明书严格进行操作。 耐药基因检测（1） 引物设计 根据GenBank公布的FG，fexA，fexB，cfr基因序列，采用primer premier 5软件进行引物自动搜索，并用Oligo6.0软件进行验证，最终设计出特异性引物，送英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，见图表1。 耐药基因检测（2） 聚合酶链式反应 反应体系20 μL ，模板2 μL ，上、下游引物各1 μL ，Taq预混酶10 μL ，去离子水6 μL 。PCR反应条件见图表2。 耐药基因检测（3） 琼脂糖凝胶电泳 将固态凝胶放入电泳槽中，加入TAE缓冲液至胶面以上1mm处；依次加入8 μL PCR产物与2μL 6 × Loading Buffer的混合物，DNA Marker DS2000作为标准，加入5μL。电压100 V，时间30min。 结果观察与凝胶成像 将电泳凝胶进行紫外透射观察，使用凝胶成像分析系统凝胶成像，记录结果。 结果 （1） 鉴定结果 29株样本全为FG阳性，均属于肠球菌菌属。见图表3。 筛选结果 29株肠球菌样本中，10株为氟苯尼考耐药肠球菌，分别为N6、N7、N8、F7、F2、F5、N37、N39、N43、Z育4。 结果（2） 耐药基因检测结果 分析与讨论(1) 筛选后得到10株氟苯尼考耐药肠球菌，其分离率为38%。 基因fexA与fexB在氟苯尼考耐药肠球菌中的检出率均为90%（9/10）,没有检出cfr，与试验菌株数量有一定关系。Corinna Kehrenberg报道cfr，fexA在氟苯尼考耐药葡萄球菌中的检出率为18%和55%，没有cfr,fexA,fexB在氟苯尼考耐药肠球菌中的相关报道。 分析与讨论（2） fexB与fexA有59.7%的平均核苷酸同源性，设计的引物特异性可能会较弱，从而导致9株肠球菌中同时显示fexA,fexB阳性；然而，Corinna Kehrenberg有关于cfr和fexA在同一个质粒上的报道，因此也有fexA与fexB在同一个质粒上的可能性。 通过本次试验，再次证实了氟苯尼考耐药肠球菌中的相关基因fexA和fexB，但没有验证这些耐药基因的具体位置，需要进一步做试验。 参考文献 Kehrenberg C, Schwarz S, Jacobsen L et al. A new mechanism for chloramphenicol, florfenicol and clind