第二十二章 金免疫技术COLLOIDAL GOLD IMMUNOASSAY TECHNIQUE.pptVIP

金免疫技术 信阳职业技术学院 药学与检验系 金免疫技术 金免疫技术（colloidal gold immunoassay technique）是一种以胶体金作为标记物的免疫标记技术。 1970s由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。 金免疫技术用于: 免疫组织化学染色; 金免疫测定 第一节 胶体金与免疫金的制备 一、胶体金特性及其制备 二、免疫金的制备 三、免疫金的保存 一、胶体金特性及其制备 1.胶体金的结构 2.胶体金性状 3.胶体金的制备 4.胶体金鉴定 5.胶体金保存 6.注意事项 1.胶体金的结构 胶体金（colloidal gold）也称金溶胶（gold solution），是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。 胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。 胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒（一般指大于30nm以上的）多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态。 2.胶体金性状 （1）胶体金一般性质： 胶体金颗粒大小多在1～100nm，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。胶体金因而具有胶体的多种特性，特别是对电解质的敏感性。 （2）胶体金的颜色和光吸收性：对同一种物质的水溶胶金颗粒来说，粒子大小不同，颜色亦不同： 胶体金颗粒在5～20nm之间，吸收波长520nm，呈葡萄酒红色。 胶体金颗粒20～40nm之间吸收波长530nm，液体为深红色，60nm的金溶液主要吸收波长600nm，金溶液呈兰紫色，若离心去掉较大的金颗粒，溶胶呈红色。 根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色或吸收峰波长大小可粗略估计金颗粒的大小。 3.胶体金的制备 （1）制备原理 向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子，形成金颗粒悬液。目前常用的还原剂有：白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等。 （2）操作要点 最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。 四种粒径胶体金的制备及特性 4.胶体金鉴定 制好高质量的胶体金却也并非易事。 可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径。制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作显微摄影，可以比较精确地测定胶体金的平均粒径。 良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。 5.胶体金保存 胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如0.02％NaN3）可有利于保存。 6.注意事项 （1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。 （3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。 （4）用以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。 二、免疫金的制备 免疫金 是指胶体金与抗原（抗体）的结合物,在免疫组织化学技术中，习惯上要称之为金探针。 1.制备原理 胶体金颗粒表面带负电荷，与蛋白质的正电荷基团间靠静电力相互吸引，达到范德华引力范围内即形成牢固的结合,同时胶体金颗粒的粗糙表面也是形成吸附的重要条件。 因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附 2.技术要点 胶体金溶液的pH值调整 用K2CO3或HCl溶液调节胶体金溶液的pH至选定值。 蛋白质最适标记量的确定 标记过程 在电磁搅拌下将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，反应一定时间后加入 BSA并调整pH至8.5，放置室温继续反应数分钟。 离心分离 三、免疫金的保存 免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入含稳定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲液。PEG和BSA是最常用的稳定剂。 稳定剂有两大作用：①为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存；②为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。 第二节 金免疫测定 一、斑点金免疫渗滤试验 二、 斑点金免疫层析试验 一、斑点金免疫渗滤试验 原理: 斑点金免疫渗滤试验是将抗原或抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上（这种固相载体具有过滤性能）制成抗原或抗体包被的微孔滤膜贴置于吸水材料上，依次滴加在膜上的标本、免疫金、及洗涤液等液体很快渗入吸水材料中，最后阳性反应在膜上呈现红色斑