结核分枝杆菌Rv3872与Rv3873基因的克隆及重组真核表达载体的构建.docVIP

　　结核分枝杆菌Rv3872与Rv3873基因的克隆及重组真核表达载体的构建 摘 要：目的：克隆结核分枝杆菌Rv3872与Rv3873基因，并构建Rv3872与Rv3873基因的重组真核表达载体，为研究这2个基因的功能奠定实验基础。方法：利用PCR技术克隆Rv3872与Rv3873基因序列，将其连接至pMD-18T载体，鉴定成功后将Rv3872与Rv3873序列插入真核表达载体pEGFP-C1，构建重组pEGFP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表达载体，并进行质粒PCR、双酶切以及测序验证。结果：经测序比对后，Rv3872与Rv3873序列与GeneBank中公布的基因序列一致，重组载体构建成功。结论：成功构建重组pEGFP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表达载体。 中国 1/vie 　　关键词：结核分枝杆菌；Rv3872；Rv3873；真核载体 　　中图分类号 R446 文献标识码 A 1007-7731（2017）08-0012-04 　　Abstract：Objective：Cloning of Mycobacterium tuberculosis Rv3872 and Rv3873 gene and constructing rebinant eukaryotic expression vector of Rv3872 and Rv3873 gene.Methods：The id e digestion and sequencing.Resluts：Rv3872 and Rv3873 tuberculosis；Rv3872；Rv3873；Eukaryotic vector 　　?Y核病（Tuberculosis）是一种因感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）而引发的人畜共患传染性疾病。2015年全世界新发结核病数量约为1 040万例，据估计有140万人死于结核病，还有40万艾滋病毒感染者死于结核病[1]。结核分枝杆菌侵入机体后，主要由肺泡巨噬细胞吞噬、消化和摧毁，但结核分枝杆菌仍可以在这种恶劣的环境下生存和复制，其根本原因在于MTB可以调控宿主免疫、干扰细胞凋亡机制，抵御机体对病原菌的清除，进而在体内复制和传播。通过DNA微阵列分析发现，弱毒性结核分枝杆菌与致病性结核分枝杆菌相比存在11个差异区（region of difference，RDs），与牛结核分枝杆菌相比存在16个RD区。RD1区是近年来人们研究的热点，由RD1区分泌的蛋白有望成为结核病潜在的候选疫苗及诊断工具。Rv3872和Rv3873分别是PE和PPE家族成员，研究表明Rv3872与Rv3873编码的PE35蛋白与PPE68蛋白在结核杆菌与巨噬细胞作用过程中发挥重要作用，能够影响宿主细胞的功能[2，3]，但目前的研究尚不能完全阐述作用机制。本研究通过分子生物学手段，克隆Rv3872与Rv3873基因并构建重组真核表达载体，为下一步研究Rv3872和Rv3873在胞内的作用机制奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 质粒和主要试剂 真核表达载体pEGFP-C1载体由厦门大学馈赠。限制性内切酶KpnI、BamHI、E×Taq酶、T4 DNA ligase、10 X T4 DNA Ligase buffer、DL 2000 DNA Marker、DL 5000 DNA Marker（TaKaRa）；质粒提取试剂盒（Gene Mark）；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒 （Axygen公司）、PCR产物纯化试剂盒（Sangon Bitech）、pMD-18T载体（TaKaRa）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 Rv3872、Rv3873基因的PCR扩增 根据Genbank中公布的Rv3872、Rv3873基因序列用Prime5.0进行引物设计，引物序列分别为P1 ：5′-ATGACAGAGCAGCAGTGGA-3′、P2：5′-CTATGCGAACATCCCAGT-3′、P3：5′-ATGCTGTGGACAGCAA-3′、P4：5′-ATGCTGTGGACAGCAA-3′，设计完成后送至上海生工生物工程有限公司合成。以人型H37Rv全基因组为模板，以P1与P2、P3与P4为引物扩增Rv3872、Rv3873基因，退火温度为63.5℃、69℃，扩增体系为P1/P2、P3/P4各1μL，ExTaq mix 12.5μL，H37Rv全基因组1μL，ddH2O 9.5μL，PCR反应参数为：95℃预变性3min，95℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃再延伸l0min，4℃保温l0min。反应结束后，制备1%